بخشی از مقاله
چکیده:
درسه دهه گذشته، گروه هاي تحقیقاتی زیادي تلاشهاي بسیاري رابه منظورتوسعه محیطهاي رشد،تکنیکهاي هوادهی، سیستمها ودستگاههاي کنترلی،استراتژيهاي کشت به منظوردستیابی به کشت سلولی با تراکم بالاي باکتري E. coli ودیگرباکتریها انجام دادهاند. fed batch ودیالیز دوروش عمده براي رشدکشت سلولی باتراکم بالا است. این استراتژيهاي ذکر شده همراه با جلوگیري از خاصیت ممانعت کنندگی استات، تراکم سلولی باکتريE. Coli را تا - 190 g/ Lوزن خشک - امکان پذیر کرده است.
مقدمه:
تاکنون، به طوردقیق مقدار وزنخشک سلولیدرهرلیتر که بتوان آن را بهعنواننمایندهیتراکمسلولیبالادرنظرگرفت،بدست نیامده است ومطالعات مختلف مقادیر مختلفی براي آن درنظرگرفته اند. مثلا موقعی که به 54گرم وزن خشک در هر لیتر از پروتوزئاها برسیم، گفته می شود که به کشت سلولی باتراکم بالا رسیه ایم در حالی که این مقدار براي باکتري ها و قارچ ها یک میزان متوسط در نظر گرفته می شود.
مثلا ۰۵گرم بر لیترو یا حتی 20 گرمبر لیتررا به عنوان کشتبا تراکم سلولی بالا در نظر گرفته اند. کشتسلولیبا تراکمبالا - HCDC - برایتولیدمحصولاتمختلف مانندتولیدآنتیبیوتیک از streptomycetesها مورد استفاده قرار می گیرد. ترکیبی ازفرآیندهاي کشت درمقیاس بزرگ باتکنولوژيDNA نوترکیب توانسته است پروتئین هایی ماننداینترفرون،اینترلوکین،عوامل محرك کلونی وهورمونهاي رشدرا درمقادیریکه اگربراي به دست آوردن آن ها،ازمنابع طبیعی استفاده کنیم، اگرغیرممکن نشود، دشوار می شود.کشت هاي سلولی با تراکم بالا،یک پیشنیازبراي به حداکثررساندن مقدارمحصول دریک حجم معین دریک زمان خاص است.
بررسی محدودیتهاي رشدمیکروارگانیسمهادرحالت کلی و به صورت اختصاصی براي اشرشیاکلی، تبدیل باکتريE. coliرا به یک ماشین تولیدي - production machine - براي پروتئینهاي هترولوگ درمیکروبیولوژي صنعتی راممکن ساخته است. امروزه،تکنیکهاي به دست آوردن بالاترین تراکم ممکن ازE. coliمولددرکشت هاي غوطه وري به خوبی توسعه یافته است.
محصولات تجاري به دست آمده ازکشت باکتريE. coli عمدتاشامل پروتئین نوترکیبی است که ازمنابع پروکاریوتی ویوکاریوتی بوده وبه نظرمیرسد که داراي حجم کمولیبا ارزش بالاهستند. علاوه براین،پیشرفتهاي اخیري که درمهندسی متابولیک بدست آمده،امکان استفاده ازباکتريE. Coliبه عنوان یک پلتفرم براي تولید محصولات با حجم بالا وارزش کم را فراهم کرده است، محصولاتی ازقبیل پلی هیدروکسی بوتیرات واسیدسوکسینیک، استانوئیکاسید،ترکیبات معطر،اتانول،استونواکسیداستایرن - لی، . - 1996 براي محصولات باحجم بالاوارزش کم،تراکم سلولی بالاوبازده حجمی بالا، دو شرط ضروري براي تولید اقتصادي آن ها است.
کشت سلولی با تراکم بالاباعث می شود که سرمایه گذاري وهزینه هاي فرآیند به طور قابل ملاحظه اي کاهش یابد. این کاهش هزینه باتوجه به کاهش اندازه تجهیزات تخمیر، امکانات بالادستی از قبیل آبت صفیه شده وبرق،بخارآب خالص،تامین هواي پاك واتاق تمیزبه دست می آید. انداز هواحدهاي فرایندپاییندستی مانندسانتریفیوژ،میکرووالترافیلتراسیون ودستگاه تصفیه نیزکاهش مییابد.
نتایج و بحث:
درسه دهه گذشته شاهدتلاشهاي مستمرانجام شده توسط بسیاري ازگروههاي تحقیقاتی،به منظورتوسعه محیطهاي رشد،تکنیکهاي هوادهی،سیستم ها ودستگاههاي کنترلی،سیستم تخمیري کنترل شده واستراتژيهاي کشت به منظوردستیابی به کشت سلولی با تراکم بالاي باکتري E. coliودیگرباکتریهابوده ایم.
عوامل موثربررشدE. coli باتراکم بالا
دراوایل کارتلاش براي رسیدن به کشت هاي با غلظت بالایی ازباکتریها، که بین سالهاي 1943 تا 1953 انجام شد، مشاهده شدکه غلظت بالاي سوبستراي اولیه درکشت هاي مایع،یک مانع اصلی براي رسیدن به رشدباکتریها با چگالی بالااست. این ایده که تنهامانع رشدنامحدودباکتریهاي موجوددرمحیط کشت مایع، مایع بودن محیط کشت است براساس این فرض است که باکتریهاتازمانی به تقسیم خود ادامه خواهددادکه نیازتغذیه اي آن ها تامین شودوعوامل سمی یاعوامل بازدارنده که درطول دوره رشدباکتري به محیط کشت دفع می شود، وجود نداشته باشد.
در مطالعات دیگري که انجام شد، باکتریهارا بااستفاده ازیک کیسه سلوفان براي جداکردن کشت ازیک منبع بزرگ موادغذایی، تکثیر دادند. بعد از چند سال این ایده توسط تیررل وهمکاران که در آن بااستفاده ازیک سیستم دوفازي براي به دست آوردن کشت خامه مانندي از Serratia marcescens باغلظت سلولی 61011 سلول زنده در هر میلی لیتر که معادل 15/5گرم وزن خشک سلولی در هر لیتر است، توسعه داده شد.
تامین اکسیژن نتایجی که درسال 1965 توسط هربرت وهمکاران به چاپرسیده است وبعدازآن توسط بوئروهمکاران در 1976-1974 تاییدشد، نشان میدهدکه عملکردثابت - yield-constant - براي اکسیژن در باکتري E. coli استرین Wکه درحال رشدروي گلوکزبه عنوان منبع کربن هست، نزدیک به 1 است 1 - گرم اکسیژن موردنیازبراي تولید 1/06 گرم اززیست توده. - E. coli ازآنجایی که یک سیستم تخمیربه طورمتوسطدر دماي 25˚Cمی تواند ۲M O ۵.۱ لیتر در هر ساعت رازمانیکه بااکسیژن خالص هوادهی شود را تامین کند،کشت E. coli به لحاظ تئوري اگر همه نیازهاي تغذیهاي دیگرآن تامین شود، میتواند به تراکم سلولی 350 گرم وزن سلولی خشک در لیترباسرعت رشد۱-0/2 h برسد. بنابراین،اگراکسیژن خالص دردسترس باشد، سرعت انتقال اکسیژن درکشت مایع نمیتواندتبدیل به یک عامل محدودکننده شود.
تامین محیط رشد
رشدباکتريE. coliمیتواندبامواردموردنیازتغذیه اي ازجمله کربن،نیتروژن،فسفر،گوگرد،آهن،پتاسیم،منیزیم،منگنز،روي،مس وبرخی ازعوامل رشد،محدودشود Gunsalus - وStanier،۰۶۹۱ - . هنگامی که باکتريE. Coliدرحال رشدبه صورت کشت با تراکم کم است،تمام موادمغذي موردنیازرامیتواندرابتدابه محیط مایع اولیه اضافه کرد. محلول کمپلکس لوریابرتانی براث - Luria Bertani - LB اجازه میدهدتاباکتريE. Coliدردرجه حرارت،pH واکسیژن تحت کنترل محیط،به تراکم سلولی،1 گرم وزن خشک سلولی در لیتر برسد.به منظور اصلاح کردن نیازهاي غذایی کشت سلولی با تراکم بالا،غلظت اجزاي سازنده محیط کشت بایدافزایش یافته وفسفر،گوگردوعناصر کم مقداربایدبه آن اضافه شود.
متاسفانه،بسیاري ازموادمحیط کشت که براي رشدباکتريE. coli مورد نیاز است، وقتی درغلظتهاي بالااضافه میشوند باعث جلوگیري از رشدباکتريE. coli می شوند.این مطلب به خوبی توسطRiesenbergوهمکاران در سال 1991 تایید شد که موادمغذي مانندگلوکزدرغلظت 50 گرمدر لیتر،آمونیوم 3 گرمدر لیتر ،آهن1/15گرمدر لیتر ،منیزیم8/7گرمدر لیتر ،فسفر 10 گرم در لیتر ورویدر0/038گرمدر لیتر ازرشد E. coli جلوگیري می کند. لی در سال 1996 یک محیط کشت ایجاد کردکه شامل حداکثرغلظت غیر بازدارنده ازموادمغذي بود که اجازه می دادرشدباکتريE. Coliبه تراکم سلولی درحدود 15 گرم وزن خشک سلولی در لیتر - DCW - برسد.
از جمله مواد مضر تولیدي توسط باکتري ایکلاي، استات است. یک راه براي کاهش تجمع استات،کاهش سرعترشد باکتري بافراهمکردن گلوکزبه آرامی است.Riesenbergدرسال 1991 پیشنهاد داده است که بااجراي این استراتژي،چرخهTCAمیتوانیدتمام استیل کوآنزیم Aتولیدشده توسط مسیرگلیکولیتیک را مورد استفاده قرار دهد،درنتیجه ازتشکیل استات جلوگیري می شود.
روش هاي خوراك دهی
چندین روشFed batch براي خوراك دهی بامنبع تغذیه کربن که میتواندبه حفظ مقدار استات درمقادیرکم کمک کند،توسعه پیدا کرده اند. این روشهابراساس مدلهاي ریاضی هستندکه الگوهاي رشدوهمچنین تقاضا براي مواد مغذي را توضیح می دهند. این مدلهابراساس مقدارمتوسطقابل پذیرش عملکرد باکتري E. coliروي محیط گلوکز 0/5 - گرم/ گرم - وتجزیه وتحلیل آنالیز عناصر سلولی باکتريE.Coli - نسبت - C:N: P: S است.
بااستفاده ازاین مدل ها،غلظت بهینه ازتمام اجزاءونرخ خوراك دهی رامیتوان محاسبه کرد-خوراك کربن باعث محدودشدن وتعیین نرخ رشدمی شود-. نگهداري نرخ رشدزیریک مقداربحرانی استات، اجازه میدهدتارشدکشت سلولی توسط پارامترهاي دیگرمحدودشود. نمونه ي این معادلات که براي تعیین میزان جریان موردنظرتوسط لی - 1996 - پیشنهادشد، به صورت زیر است.
چنین معادله اي ممکن است براي از قبل پیش بینی کردن سرعت اضافه کردن در قسمت خطی یاقسمت نمایی - با اتصال پمپ تغذیه به کنترل کننده - مورداستفاده قرار می گیرد. براین اساس،مقدار کربن موردنیازرا کنترل کننده، محاسبه کرده و براساس آن میزان سرعت خوراك دهی تنظیم می شود Riesenberg - وGuthke،۹۹۹۱،لی، . - 1996 یکی دیگرازروشت غذیه،استفاده ازسیستمهاي کنترلی بازخوردمستقیم وغیرمستقیم است. کنترل بازخوردغیرمستقیم برپایه مانیتور کردن آنلاین پارامترهایی مانندpH،اکسیژن محلول و غلظت سلول - چگالینوري،NAD، - ATP است.
هورن و همکاران - - 1996 اشرشیاکلی رابانظارت وکنترل دقیق غلظت تمام موادمغذي اصلی - مانندگلوکز،نیتروژنوفسفات - به چگالی 145 گرم / لیتر DCWرساندند. آنهااکسیژن محلول درطول دوره رشدکشت رابالاتر از 20٪اشباع نگهداري کردند.در کنترل بازخورد براي حفظ غلظت گلوکزدر حدي که عامل محدودکننده رشد نباشد، بایدزیر1/5گرم در لیتر طراحی شود. این کشت درحداکثر سرعت در26 ˚C وباهیچگونه تجمع استات رشد می کند. استراتژي براي کاهش تجمع استات روش مستقیم براي غلبه برتولید استات که توسط محققان مختلف که از انواع استراتژیهاي نوترکیب برایکاهش بیوسنتزاستات استفاده می کنند، شامل افزایش استفاده ازاستات وبردن مسیرگلیکولیزبه سمت مسیرهاي دیگراست.
یکی ازاین روشها، استفاده از جهش در باکتري E. coli با ایجادنقص درآنزیمهاي مسیربیوسنتزاستات و به طورخاص درفسفوترانس استیلاز - pta - واستاتکیناز - - ack است. کونتیرو وهمکاران در سال 2000 مجموعه اي ازجهشها را در ۰۰۱۳E. coli w ایجاد کردند که در آن هافعالیتهاي آنزیمی مرتبط با استات را از دست دادند .آنهابراي به اثبات رساندن این مطلب که همه جنبه هاي متابولیسم استات نقش اساسی دررشد کشت سلولی با تراکم بالاي باکتري E. coli دارد،از این مجموعه جهشها در ۰۰۱۳E. coli w استفاده کردند.
