بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه وهدف: ژنوم ویروس هپاتیت C داراي یک قالب قرائت طویل براي پلی پروتئینی است که به 10 پروتئین جداگانه بریده می شود. اخیرا پروتئین جدیدي بنام ARFP/F - Core+1 - شناسائی شده که بیان آن ناشی از یک جابجایی ریبوزومی درسکانس کد کننده پروتئین کپسید می باشد.
اگرچه ویژگیهاي بیولوژیک این پروتئین جدید هنوز ناشناخته است، بنظر می رسد نقش مهمی را در سیکل زندگی و بیماریزایی ویروس بر عهده دارد، در نتیجه مطالعه برهمکنش احتمالی آن با پروتئینهاي داخل سلولی، مشابه آنچه در مورد پروتئین کپسید ویروس گزارش شده است، حائز اهمیت می باشد. مطالعه حاضر با هدف تولید اولیه دو قطعه نوترکیب از پروتئین ARFP/F بمنظور ارزیابی آتی آنها طراحی شده است.
روش: بر اساس آنالیزهاي کامپیوتري ویافتن اپی توپهاي احتمالی، قطعات آمینو اسیدي 86-161 و 43-143 انتخاب شده، سکانسهاي نوکلئوتیدي آنها توسط PCR تکثیر شده و در وکتور pET24a کلون شدند. آنالیز آنزیمی و تعیین توالی صحت مراحل کلونینگ را نشان داد. بیان پروتئین در حضور IPTG در E.coli BL21 - DE3 - القاء شده، پروتئینها بوسیله SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی شدند و با ستون Ni-NTA در شرایط تقلیب تخلیص شدند. با دیالیز در گرادیان کاهشی اوره، بازارایی آنها به فرم طبیعی صورت خواهد گرفت.
نتیجه: پلاسمیدهاي ساخته شده قطعات انتخابی Core+1 را با موفقیت در اندازه هاي مورد انتظار 11 - و 14 کیلودالتون - بیان کردند. این پروتئینهاي نوترکیب توسط آنتی بادي ضد His-tag با روش وسترن بلات تائید شده و بروش کروماتوگرافی میل ترکیبی تخلیص شدند. پس از بازارائی برهم کنش احتمالی آنها با پروتئینهاي داخل سلولی بررسی خواهد شد.
مقدمه
هپاتیت c عامل اصلی بیماریهاي حاد ومزمن کبدي شامل سیروز وسرطان کبد می باشد. بر اساس گزارش سازمان بهداشت جهانی در حال حاضر 170میلیون نفر مبتلا به عفونت HCV دردنیا وجود دارد - حدود3درصد از جمعیت جهان - . - - 1نبود واکسن، شیوع بالاي عوارض کشنده، پاسخ نامناسب به درمان و گسترش روز افزون هپاتیت c، آن را به یک معضل بهداشتی-جهانی تبدیل نموده است
به علت عدم وجود مکانیسم تصحیح خطا1 در آنزیم RNA پلی مراز در زمان تکثیر ویروس، HCV در بدن افراد مبتلا دچار تغییراتی در ساختار ژنتیکی شده و ساب تیپ هاي جدیدي تحت عنوان quasispecies تولید می کند. - - 3مطالعات نشان می دهد که ژن مولد پروتئین هسته - core - در ویروس هپاتیت C علاوه بر این پروتئین، پروتئین دیگري در یک ORF جدید تولید می کند.
ترتیب قرار گرفتن نوکلئوتید ها در این پروتئین جدید نسبت به ORF پروتئین قبلی یکی تغییر می کند که این تغییر بصورت 1+ است . - core+1 ORF - پروتئین جدید تحت عناوین ARFP2 ، پروتئین - Frameshift - F یا core+1 - که نشان دهنده جایگاه ORF جدیداست - خوانده شده و طول آن از 126تا 162 اسیدامینه متغیر است. - - 4 پروتئین ساختاري Core علاوه بر تشکیل نوکلئوکپسید ویروسی در همانندسازي، ورود، مورفوژنز، پاتوژنز، سرهم بندي و پیشرفت بیماري به سمت سیروز وسرطان نقش دارد، در حالیکه هنوز عملکرد پروتئین F شناخته نشده است.
بسیاري از مطالعات جدید نشان داده اند که میزان بیان ARFP ها در بیماران فاز وخیم کبد، سیروز و سرطان - HCC - بالاتر بوده و آنتی بادیها و پاسخ هاي ایمنی سلول هاي T علیه ARFP ها در این بیماران به میزان بسیار گسترده اي وجود دارند - 8و - 9 و به علاوه تمامی سکانس هایی از HCV که ثابت شده است عفونت زا هستند داراي ARF به صورت شیفت +1 ریبوزومی می باشند. - - 5از طرفی در مطالعات با میکروسکوپ کنفوکال ارتباط core با میکروتوبولها درسلولهاي آلوده به HCV نشان داده شده است.
بوسیله روش Pulldown و بدنبال ان mass spectrometry، مشخص شده که توبولینهاي A و B با Core درسلول مرتبط می باشند. افزایش پلیمریزاسیون میکروتوبول واثر متقابل core باتوبولین در انتشار الودگی وپیشرفت انتقال ویروس موثر است - 10 - ، در نتیجه با توجه به اهمیت پروتئین Core+1 بررسی هایی پیرامون نقش این پروتئین در سلول کبدي ومیان کنش آن با پروتئینهاي سلولی ونیز بررسی هاي ایمونولوژیک حائز اهمیت است. با توجه به این توضیحات هدف از مطالعه حاضر، ساخت سازه بیان کننده قطعات انتخابی 86-161 و43-143 از پرونئین Core+1 است بطوریکه در مطالعات بعدي بتوان از این پروتئینها براي بررسیهاي ایمونولوژیک و سلولی مانند واکنشهاي احتمالی بین core+1 و پروتئین هاي سلولی استفاده کرد.
مواد و روشها
قطعات آمینواسیدي 43-143و86-161، توسط آغازگرهاي3 طراحی شده - حاوي توالی برش آنزیم هايBamH I و - Xho I از روي ژن Core تکثیر شده و در محا برش دو آنزیم مذکور در پلاسمید پروکاریوتی - Novagen - pET24a - + - کلون شدند. برنامه PCR عبارت بود از 5 دقیقه در 94 درجه و 30 سیکل - 94 درجه بمدت 1 دقیقه، 45 درجه بمدت 1 دقیقه و 72 درجه بمدت 60 ثانیه - که در نهایت بمدت 10 دقیقه در 72 درجه خاتمه یافت.
مخلوط حاصل از پلاسمید و محصول PCR بریده شده پس از انجام لیگیشن، جهت تکثیر و غربالگري به باکتري اشرشیاکلی سویه DH5α ترانسفورم شده و بعد از تکثیر و استخراج با آنالیز آنزیمی و تعیین سکانس تائید شدند.
پلاسمید pET 24a - + - نوترکیب،براي ابراز پروتئین به باکتري E.coli سویه BL21 ترانسفورم شد. وسلولهاي حاصل وسلولهاي حاوي وکتوربدون ژن الحاقی - بعنوان کنترل - براي بیان القا شدند. به منظور بهینه سازي بیان پروتئین نوترکیب، پارامترهایی نظیر نوع محیط کشت، دماي رشد ومدت زمان القا بررسی شدند. رسوب حاصل از 1 میلی لیتر کشت القا شده باکتري بوسیله SDS-PAGE آنالیز شده و بدنبال انتقال باندهاي پروتئینی به کاغذ نیتروسلولز با استفاده از مونوکلونال آانتی بادي اختصاصی علیه 6xHis-tag توسط روش وسترن بلات تائید شدند.
تخلیص پروتئین هاي مذکور در حالت Denature بواسطه حضور برچسب 6xHis-tag در پروتئین نوترکیب، با استفاده از ژل آگارز Ni-NTA و مطابق دستورالعمل شرکت Qiagen انجام پذیرفت.
نتایج وبحث:
نتایج حاصل ازانالیز انزیمی با BamH I/XhO I - شکل 1و - 2 و نیز تعیین سکانس نشان داد که کاست بیانی به همراه پروموتور T7، محل اتصال ریبوزوم، کدون آغازي - ATG - ، قطعه ژن 86-161 - و - 43-143، بر چسب هیستدینی - 6X His - tag و سکانس پایانی، در ترادف مناسب و به صورت پشت سرهم قرار گرفته اند.
الکتروفورز پروتئین - شکل3و - 4 نمایانگر آن بود که میزان تولید پروتئین نوترکیب پس از 3 ساعت از القا در دماي 37 درجه و دانسیته سلولی 0/6 در OD600 به حداکثر خود می رسد. همانطور که در شکل دیده می شود پس از القاي IPTG ابراز پروتئین نوترکیب دیده می شود.اندازه باندهاي پروتئینی براي قطعات 43-143و86-161 از لحاظ تئوري و محاسباتی به ترتیب 14و11 کیلودالتون پیش بینی می شود. در نهایت آنالیز وسترن بلات - شکل - 5 نیز نشان داد که پروتئین نوترکیب توسط مونوکلونال انتی بادي اختصاصی قابل شناسایی است.
