بخشی از مقاله
چکیده
زمینه و هدف: میتونین گاما لیاز از خانواده لیازها و آنزیمهای وابسته به پیرودکسال فسفات است که اسیدهای آمینه دارای گروه سولفور را به آلفاکتواسیدها، آمونیا و تیول کاتالیز می نماید. از آنجا که اسیدهای آمینه دارای گروه سولفور نظیر هموسیستئین و میتونین نقش مهمی در فرآیندهای بیولوژیکی داشته و میزان آنها در بدن با برخی بیماریها نظیر هموسیستینوریا مرتبط است از این رو اندازهگیری و شناسایی آنها حائز اهمیت می باشد. میتونین گاما لیاز در نقش معرفهای تشخیصی در آنالیزهای آنزیمی، ساخت کیتهای غربالگری و زیست حسگرها مورد استفاده قرار می گیرد.
از این رو دستیابی به آنزیمهایی از این خانواده که دارای ویژگیهای کاتالیزی متمایز باشند از اهمیت قابل توجهی برخوردار است. روشها: ابتدا ژن آنزیم از سوش Citrobacter freundii جدا شده و سپس با کمک روشهای مهندسی ژنتیک فرم نوترکیب آن تولید شد.
بیان آنزیم نوترکیب توسط روشهای سنجش فعالیت بیولوژیک و SDS- PAGE تایید شده و با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گردید. خصوصیات کینتیکی و فیزیکو شیمیایی آنزیم تولید شده نظیر پارامترهای کینتیکی، دما و pH بهینه ی فعالیت و پایداری آنزیم، pH ایزوالکتریک، ترکیب آمینواسیدی و جرم مولکولی نیز مطالعه شدند.
نتایج: بهترین شرایط برای تولید میتونین گاما لیاز نوترکیب با 0/5 IPTGمیلی مولار در دمای 23 درجه سانتی گراد و زمان القاء 5 ساعت به دست آمد و فعالیت آنزیم تولید شده، 2100 U/ml محاسبه شد. ترادف نوکلئوتیدی آنزیم، پروتئینی به طول 398 آمینواسید را کد می نمود و وزن مولکولی هر زیر واحد توسط الکتروفورز SDS-PAGE، 43 کیلو دالتون تخمین زده شد. بحث و نتیجه گیری: در مجموع، ژن آنزیم میتونین گاما لیاز از باکتری C. freundii جداسازی و کلون شد و فرم نوترکیب آن در E. coli بیان گردید..
-1مقدمه
میتونین گاما لیاز از خانواده لیازها و آنزیمهای وابسته به پیرودکسال فسفات است که اسیدهای آمینه دارای گروه سولفور را به آلفاکتواسیدها، آمونیا و تیول کاتالیز می نماید. از آنجا که اسیدهای آمینه دارای گروه سولفور نظیر هموسیستئین و میتونین نقش مهمی در فرآیندهای بیولوژیکی داشته و میزان آنها در بدن با برخی بیماریها نظیر هموسیستینوریا مرتبط است از این رو اندازهگیری و شناسایی آنها حائز اهمیت می باشد. میتونین گاما لیاز در نقش معرفهای تشخیصی در آنالیزهای آنزیمی، ساخت کیتهای غربالگری و زیست حسگرها مورد استفاده قرار می گیرد. از این رو دستیابی به آنزیمهایی از این خانواده که دارای ویژگیهای کاتالیزی متمایز باشند از اهمیت قابل توجهی برخوردار است.
-2مواد و روشها:
-1-2 تهیه DNA ژنومیک از باکتری
در مرحله ابتدایی، DNA کروموزومی باکتری توسط پروتوکلهای استاندارد موجود تخلیص شده و صحت تخلیص توسط روشهای االکنروفورز ژل آگاروز و اندازه گیری OD260/280 تایید می شود.
-2-2 طراحی پرایمر
با استفاده از روی هم اندازی توالیهای ژنهای همولوگ گزارش شده از این آنزیم موجود در GenBank و شناسایی نواحی حفاظت شده در قسمتهای فرادست و فرودست ژن مورد نظر توسط نرم افزار DNASIS MAX 3.0، با کمک نرم افزار طراحی پرایمر Oligo 7.0 برای آن پرایمر طراحی کرده و ژن آنزیم هدف را با روش PCR تکثیر می نمائیم.
-3-2کلونینگ و بیان ژن متیونین گامالیاز
پس از تخلیص حامل کلونینگ، ابتدا ژن میتونین گامالیاز توسط پرایمرهای الیگو نوکلئوتیدی حاوی جایگاههای برش آنزیمهای محدوالاثر KpnI و PCR XbaІ شده و پس از برش با آنزیمهای مذکور و خالص سازی از روی ژل به داخل حامل pRSETA که توسط برش با آنزیمهای KpnI و XbaІ و نیز تیمار شدن با آنزیم آلکالین قسفاتاز خطی می شود، وارد خواهد شد.
پلاسمید نوترکیب ساخته شده به داخل باکتری E. coli BL21 - DE3 - ترانسفورم شده و بر روی محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین کشت داده می شود. پس از شناسایی و تایید پلاسمید نوترکیب توسط روشهای Double digest و توالی یابی، بیان آنزیم نوترکیب تولید شده توسط افزودن IPTG انجام شده و پروتوکل بیان توسط پارامترهای غلظت IPTG، دمای القاء، زمان القاء و مدت زمان کشت بهینه خواهد شد. تأیید آنزیم نوترکیب تولید شده توسط روشهای سنجش فعالیت بیولوژیک و SDS- PAGE صورت خواهد گرفت.
-4-2 خالص سازی و مطالعه خصوصیات کینتیکی :
میتونین گامالیاز نوترکیب تولید شده را تخلیص کرده و صحت تخلیص را توسط SDS-PAGE آنالیز می نمائیم. در خصوصیات کینتیکی پارامترهایی نظیر Km، Vmax، Kcat، Kcat /Km، اختصاصی بودن سوبسترا و تاثیر عوامل مهارکننده نظیر کاتیونهای دوظرفیتی بر فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار می گیرند.
.3 نتایج و بحث:
ابتدا ژن آنزیم میتونین گامالیاز از باکتری C. freundii با استفاده از پرایمرهای طراحی شده بر اساس توالیهای همولوگ و انجام واکنش PCR استخراج گردید و هویت آن با کمک تعیین توالی،آنالیز برش توسط آنزیمهای محدوالاثر و انجام مطالعات BLAST اثبات گردید. پس از به دستیابی به ژن متوینی گامالیاز، ژن مربوطه در حامل بیانی pRSETA کلون گردید - شکل - 1 و فرم نوترکیب آن در E. coli Codon plus - RIL - تولید گردید. آنزیم نوترکیب تولید شده توسط کروماتوگرافی تمایلی در ستون Ni-NTA خالص سازی شدو پارمترهای کینتیکی آن مطالعه گردید.
بر اساس الگوی حرکت پروتئین در ژل SDS-PAGE و مقایسه آن با استانداردهای وزن مولکولی، وزن مولکولی آنزیم 34 کیلو دالتون تخمین زده شده که با محدوده وزن مولکولی گزارش شده برای آنزیمهای این خانواده مطابقت داشت. مقادیر Km و Vmax به ترتیب 0/6 میلی مولار و 3/2 میکرومولار بر دقیقه محاسبه شدند. فعالیت آنزیمی متیونین گامالیاز3300 U/mL محاسبه گردید که نشان دهنده بازده خوب آنزیم نوترکیب تولید شده است. در مجموع، فرم نوترکیب آنزیم متیونین گامالیاز با موفقیت از C. freundii تولید شد.
شکل.1 محصول PCR و برش پلاسمید نوترکیب حاوی ژن کلون شده میتونین گامالیاز توسط آنزیمهای محدود الاثر
KpnI و - 1 .XbaІ محصول PCR بر روی ژن آنزیم 1 - کیلو باز - . - 2 پلاسمید تخلیص شده قبل از برش. - 3 پلاسیمد
برش یافته با دو آنزیم.
شکل.1 فر آیند آنالیز بهینه سازی بیان آنزیم متیونین گامالیاز. تاثیر زمانهای مختلف بر میزان بیان آنزیم نوترکیب. القاء با 1 IPTGمیلی مولار در دمای 30 درجه سانتی گراد انجام گرفت. 2 - 1ساعت پس از القاء. 4 - 2 ساعت پس از القاء. - 3 6ساعت پس از القاء.
