بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم فیتاز برای افزایش دسترسی به فسفر در تغذیه حیوانات تک معدهای به کار میرود. هدف تعیین میزان مهارکنندگی یا فعالکنندگی عصاره متانولی اندامهای هوایی برخی از گیاهان بومی استان کردستان بر روی فعالیت آنزیم فیتاز گیاهی بود.
روش سنجش اسپکتروفتومتری و قرائت جذب در طولموج 405 نانومتر بود. در میان عصارههای متانولی سنجش شده، چهار گیاه Pedicularis sibthorpii Boiss، Phlomis persica Boiss، Solenanthus circinatus Ledeb، Stachys lavandulifolia Vahl، اثر مهارکنندگی و شش گیاه Astragalus caraganae Hohe، Hypericum scabrum L، Linum album Ky.ex Boiss، Valeriana sisymbriifolia Vahl، Euphorbia denticulate Lam، Rindera lanata - Lam. - Bge، اثر فعالکنندگی بالاتر از %50 نشان دادند.
مقدمه و هدف
اهمیت مواد معدنی در تغذیه حیوانات از حدود 2000 سال پیش مشخصشده است. در متون علمی وجود 21 عنصر معدنی در جیره ضروری تشخیص دادهشده است. مواد معدنی در حدود 4 درصد وزن بدن اکثر مهرهداران را تشکیل میدهند که کلسیم و فسفر بیش از نیمی از این مقدار را در بر میگیرند. در این میان کلسیم و فسفر به لحاظ مقدار نسبی حضور در جیره، هزینه تأمین و نیز عوارض سوء ناشی از عدم تأمین آنها به مقدار کافی بیشترین توجه را به خود جلب نمودهاند
فسفر برای حیوانات یک عنصر ضروری میباشد که علاوه بر داشتن نقش حیاتی در توسعه و نگهداری بافت اسکلتی، در بسیاری از اعمال متابولیکی نیز اهمیت دارد
فیتک اسید یک فرم آلی فسفر است که برای جانوران تک معدهای از قبیل ماکیان، خوکها، ماهیان، انسان و پرندگان قابلدسترس نیست؛ چون این جانوران سطح مناسبی از آنزیمهای هیدرولیز کننده فیتات در دستگاه معدی-رودهای خود ندارند
فیتات - میو-اینوزیتول هگزا فسفات - فرم اصلی ذخیرهی فسفر دردانههای غلات، حبوبات، دانهی گرده و دانههای روغنی است . این مولکول بسیار باردار است و 6 گروه فسفات از حلقه میواینوزیتول مرکزی آن امتداد دارند.
به همین دلیل، فیتیکاسید یک فاکتور ضد تغذیهای برای انسانها و دامها به شمار میرود؛ همچنان که یک شلاتور خوبی برای کاتیونهایی از قبیل Ca2+، Mg2+، Fe2+/3+، Zn2+،K+، Mn2+ وCu2+ است و از جذب مواد معدنی در دستگاه گوارش جانوران جلوگیری میکند و همچنین به علت اتصال به مواد مغذی، آمینواسیدها و چربیها، سبب عدم جذب آنها شده و با اتصال به پروتئینها، سبب جلوگیری از عملکرد صحیح آنها در داخل غذای حیوانات میگردد درنتیجه میزان این مواد غذایی را در رژیم غذایی کاهش میدهد.
به علت نداشتن آنزیم فیتاز، مقدار زیادی از فسفر به همراه سایر مواد معدنی و غیره از بدن حیوانات تک معدهای دفع میگردد. فیتاتهای تجزیه نشده، نهتنها سبب کاهش کیفیت مواد غذایی شده بلکه سبب آلودگیهای زیستمحیطی نیز میشوند
آنزیم فیتاز - EC 3.1.3.8 - یک افزودنی مهم تغذیهای برای افزایش دسترسی به فسفر و دیگر مواد معدنی تغذیهای است که برای حیوانات تک معدهای به کار میرود و فیتیکاسید را هیدرولیز میکند
فیتازها کاربردهای بیوتکنولوژی در زمینههای مختلف ازجمله در حمایت محیطزیست، آبزیپروری و کشاورزی دارند .[9,10] آنزیمهای فیتاز همچنین بهعنوان یک مکمل برای افزایش جذب آهن در انسان، بهعنوان یک مکمل در غذای ماهی کاربرد دارد. این آنزیمها، همچنین در صنعت نانوایی، صنایع غذایی و جداسازی پروتئینهای گیاهی نیز کاربرد دارند
فیتازها گروه ویژهای از فسفاتازها یا فسفریک مونواستر هیدرولازها بهحساب میآیند که قادر به هیدرولیز فیتات میباشند .[12] این دسته از آنزیمها در طبیعت گسترده هستند و فعالیت فیتازی در گیاهان، جانوران و ریزسازوارهها گزارششده است که قادر به رهاسازی فسفات از فیتات بوده که منبع اصلی فسفر در دانه گیاهان میباشد
بدون شک افزایش توجه عمومی به مسائل محیطی، بهبود تغذیه دام و سلامت انسان باعث توجه به توسعه بیوتکنولوژی فیتازها و کاربرد آنها در حیطههای مربوطه شده است
تئوری و پیشینه تحقیق
گیاهان به علت تنوع زیستی و ساختمان اجزایشان، منابع منحصربهفرد و تجدید شدنی برای کشف داروهای جدید هستند. در کشورهای صنعتی حدود 50 درصد از داروهای تجویزشده از گیاهان مشتق شده است و طبق اعلام سازمان بهداشت جهانی، گیاهان برای حدود 3/4 میلیارد نفر بهعنوان اولین منبع دارویی در کشورهای درحالتوسعه محسوب میشود.
از نظر تأثیر مواد مختلف بر روی فعالیت آنزیم یونهای مختلف مانند روی، مس، فلوراید و EDTA میتوانند اثر مهارکنندگی و فعالکنندگی داشته باشند ولی تاکنون گزارشی از اثر گیاهان و عصاره آنها گزارش نشده است؛ در این پژوهش برای اولین بار تأثیر عصاره متانولی اندامهای هوایی گیاهان مختلف مورد سنجش قرارگرفته است؛ بنابراین یافتن گیاهانی که درصد فعال یا مهار بالایی دارند،احتمالاً میتواند راهحل طبیعی و کمهزینه، بدون اثرات جانبی برای مهار یا فعالکنندگی آنزیم فیتاز باشد.
مواد و روشها
مواد شیمیایی
آنزیم فیتاز گیاهی استخراجشده از دانه گندم رقم سرداری، پارا نیترو فنیل فسفات، استات سدیم، کلرید کلسیم، محلول Tween 20، از شرکت سیگما - آلدریچ - Sigma-Aldrich - و متانول و سایر مواد شیمیایی از شرکت مرک - Merck - آلمان تهیه شدهاند.
نمونههای گیاهی
اندامهای هوایی گیاهان، از مناطق اطراف شهر سنندج توسط آقای مهندس معروفی کارشناسی ارشد سیستماتیک گیاهی جمعآوری و به مرکز تحقیقات کشاورزی استان کردستان ارسال شدهاند. پس از شناسایی و ردهبندی، بلافاصله به محل نگهداری آزمایشگاه گروه علوم زیستی منتقل شدند. گیاهان جمعآوریشده در سایه و دمای محیط آزمایشگاه خشک شدند. قبل از تهیه پودر از نمونهها، آنها ازلحاظ نظافت و عدم آلودگی به خاک و یا سایر گیاهان بررسی شدند. سپس بهوسیله قیچی باغبانی به قطعات کوچکی خردشده و بهوسیله آسیاب خانگی مولینکس بهصورت پودر نرم درآمدند. پودرهای بهدستآمده پس از توزین در ظروف دربدار پلاستیکی تا زمان عصارهگیری، در دمای اتاق نگهداری شدند.
تهیهی عصاره متانولی
حدود 10 گرم پودر گیاهی در 100 میلیلیتر متانول خالص به مدت 24 ساعت - در ظروف تیره و به دور از نور - خیسانده و سپس توسط کاغذ صافی واتمن شماره 42 صاف شد. مایع صافشده با استفاده از دستگاه روتاریاواپریتور در دمای 65 درجه سانتیگراد تغلیظ شده و پس از تخلیه از مخزن دستگاه، جهت خشک شدن کامل، روی شیشه ساعت به قطر 15 سانتیمتر، پخششده و در زیر هود شیمیایی و در دمای محیط قرار گرفت. عصارههای خشکشده از روی سطح شیشه ساعت جمعآوری و در میکروتیوب تا زمان انجام مراحل بعدی در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
تخلیص عصاره آنزیم
برای استخراج آنزیم فیتاز از روش گیبسون1 و یولا2 با مختصر تغییراتی استفاده شد .[18] حدود 100 گرم از دانه گندم رقم سرداری آسیاب گردید و بعد از غربال از صافی 0/5 میلیمتری؛ 10 گرم از پودر غربالشده در 100 میلیلیتر محلول بافر غذا - استات سدیم، کلرید کلسیم 0/1 مولار، محلول تویین - 5/5 pH 20 حل شد. پس از هم زدن به مدت 60 دقیقه، بشر حاوی مواد فوق به مدت 15 دقیقه بر روی یخ قرار گرفت و بعد از این مدت مایع رویی این بشر از کاغذ صافی عبور داده شد و در بشر دوم جمعآوری گردید سپس محتویات آن توسط سرنگ از فیلتر PVDF به قطر0/45 میکرومتر عبور دادهشده و در بشر سومی جمعآوری شد و پس از آن در میکروتیوبهای یک میلیلیتری ریخته شد و در دمای -20 درجه سانتیگراد تا مراحل بعدی نگهداری شد. در مراحل بعدی برای رقیقسازی آنزیم از بافر رقیقسازی - اسید استیک 4 مولار، استات سدیم سه آبه، کلسیم کلرید دو آبه، محلول تویین - 5/5 pH 20 استفاده شد.
سنجش اثر عصارهها بر روی فعالیت آنزیم فیتاز
اندازهگیری فعالیت فیتاز به روش اسپکتروفتومتری انجام شد. در این مطالعه جهت سنجش قدرت فعالکنندگی و مهارکنندگی عصارههای گیاهی بر روی فعالیت آنزیم فیتاز، از روش اصلاحشدهی تران3 و همکاران استفاده گردید .>19@ همه عصارهها در چهار غلظت 0/001، 0/01، 0/1 و 1 میلیگرم بر میلیلیتر تست شدند. سنجشها در میکروپلیتهای 96 چاهکی و در حجم کل 150 میکرولیتر - l - و با استفاده از دستگاه میکروپلیتخوان به ترتیب زیر انجام شد. 100 l از بافر سدیم استات، 1/2 - 10 l رقیقشده استوک - از آنزیم فیتاز و 20ʽl از سوبسترا - 6 mM - و 20 ʽl از عصاره - محلول در آب مقطر - ، وارد چاهک شد.
پس از 30 دقیقه انکوبه کردن در دمای 45 درجه سانتیگراد، برای توقف واکنش 50µl سود - 0/1M - به مخلوط فوق اضافه گردید. آنگاه میکروپلیت درون دستگاه میکروپلیتخوان قرارگرفته، جذب آن در طولموج 405 نانومتر قرائت شد. سنجشها با سه بار تکرار انجام شد.
همچنین برای سنجشهای هر روز، کنترل منفی استفاده گردید. در چاهک کنترل منفی بجای عصاره از بافر فسفات استفاده شد. پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهکهای متناظرش کسر شده و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه گردید. سرعت واکنش بر اساس شیب نمودار جذب علیه زمان محاسبه شد. با استفاده از رابطه - 1 - درصد مهار فیتاز بهوسیله عصاره بدست آمد. در این معادله عدد منفی بدست آمده نشاندهنده فعالکنندگی عصاره متانولی میباشد. تمام این مراحل با استفاده از نرم افزار اکسل انجام شده است.
نتایج و بحث
در میان همه گیاهان تست شده، گیاهانی که اثرِ مهارکنندگی و فعال کنندگی بالایی %50 را داشتهاند در گروه گیاهانی با خاصیت قوی طبقهبندی شدند.
