بخشی از مقاله
مقدمه و هدف:
سوختن ترکیبات گوگرددار موجود در سوخت هاي فسیلی منجر به آزاد شدن سولفور دي اکسید می شود که اثرات مخربی بر روي سلامت، محیط زیست و اقتصاد دارد. روش جاري جهت حذف سولفور از سوخت هاي فسیلی روش هیدرودسولفوریزاسیون است، که نیاز به فشار و دماي بالا دارد. سولفورزدایی بیولوژیک یک تکنولوژي حامی محیط زیست است که قادر به حذف گوگرد از ترکیبات آلی مقاوم تحت شرایط دما و فشار ملایم بدون کم کردن کیفیت محصولات نفتی است.
دي بنزوتایوفن - DBT - به عنوان یک ترکیب گوگردي آلی در سوخت هاي فسیلی از طریق میکروبی به -2هیدروکسی بایفنیل تبدیل می شود و ژن هاي اپرون dszABC براي سولفورزدایی DBT لازم است.
روش ها: براي افزایش کارایی سولفورزدایی بیولوژیک، اپرون dszABC از باکتري Rhodococcus erythropolis IGTS8 با استفاده از پرایمرهاي ویژه تکثیر شد. قطعه 3/8 کیلوبازي بدست آمد و توسط وکتور pVLT31 در باکتري بومی Klebsiella oxytoca کلون شد. براي تایید وجود ژن هاي گوگردزدا، از هضم آنزیمی و تکنیک PCR استفاده شد و فعالیت سولفوزدایی باکتري نوترکیب از طریق تست گیبس به اثبات رسید.
نتیجه: با مهار سولفور از طریق جایگزین کردن پروموتور کلبسیلا نوترکیب قادر به سولفورزدایی، دي بنزوتایوفن با کارایی بیشتري است.
مقدمه:
از سوختن ترکیبات گوگرددار در سوخت هاي فسیلی اکسیدهاي گوگرد منتشر می شود که اثرات مضر بر روي سلامتی، محیط زیست و اقتصاد دارد. So2 در میان اکسید هاي گوگرد فراوان تر است و در اتمسفر پایین تر تولید می شود. گاز So2 می تواند با رطوبت هوا واکنش دهد که منجر به باران اسیدي یا مه هایی با pH پایین می شود3]،[8؛ اسیدي که از این طریق تشکیل می گردد می تواند فرسایش بنا هاي تاریخی را تسریع کند، با انتقال به خاك، به شاخ و برگ درختان آسیب بزند، باعث کاهش pH آب دریاچه ها با قابلیت بافري پایین شود و در نتیجه زندگی آبزیان را به خطر بیاندازد. به همین دلیل از سال 1979، کانادا، ایالات متحده و اتحادیه اروپا چندین تفاهم نامه براي کاهش و کنترل انتشار So2 امضا کردند
یکی از روش هاي رایج براي کاهش گوگرد از سوخت هاي میان تقطیر و گازوئیل، هیدرودسولفوریزاسیون - HDS - است. در این روش، اتم گوگرد در ترکیبات گوگردي در حضور کاتالیست هاي CoMo/Al2o3 یا NiMo/Al2o3 و گاز H2 به H2S احیا می شود.[8] پس از آنH2S در حضور هوا به گوگرد عنصري اکسید می شود. بسته به نوع هیدروکربن و درجه دسولفوریزاسیون، HDS ممکن است در دماي 200-425 °C و فشار 150-250 psi H2 انجام شود. براي رسیدن به غلظت هاي پایین تر گوگرد - - <15 mg/Kg دما و فشار بالاتري مورد نیاز است
با وجود این که HDS به راحتی قادر است ترکیبات گوگرد معدنی و آلی ساده را حذف کند اما براي حذف ترکیبات پلی سیکلیک پیچیده مانند دي بنزوتایوفن و مشتقات آلکیله آن که به عنوان ترکیبات مدل براي اجزا گوگرد آلی سوخت هاي فسیلی در نظر گرفته می شود، موثر نیست .[5] سولفورزدایی بیولوژیکی را می توان به عنوان یکی از روش هاي جایگزین در نظر گرفت
تعدادي از میکروارگانیسم ها شناخته شده اند که با برش اختصاصی باندهاي کربن-گوگرد در ترکیبات حاوي سولفور آلی باعث افزایش ارزش افزوده این ترکیبات از نظر سطح انرژي حفظ شده می گردند. باکتري رودوکوکوس اریتروپولیس IGTS8، شاخص ترین باکتري به عنوان یک سویه مدل در تحقیقات سولفورزدایی مورد استفاده قرار می گیرد. در این باکتري سه ژن مسئول سولفورزدایی از DBT شامل dsz A,B,C بر روي یک پلاسمید خطی 120 کیلو بازي قرار گرفته است. این پلاسمید سه ژن dsz A,B,C را در یک آرایش اپرونی به طول 3/8 کیلوبازي حمل می کند که با همکاري پروتئین چهارمی به نام dszD که توسط ژنی خارج از اپرون کد می شود در مسیري به نام 4S مسئول متابولیسم DBT به -2هیدروکسی بایفنیل - 2-HBP - و سولفات می باشند
هدف از انجام این طرح جداسازي اپرون سولفورزدایی از باکتري رودوکوکوس اریتروپولیس IGTS8 و انتقال آن به سویه بومی باکتري K. oxytoca تحت کنترل پروموتور هیبریدي tac و بررسی بیان بیوشیمیایی این ژن می باشد.
مواد و روش ها:
سویه هاي باکتریایی: سویه باکتري بومی K. oxytoca که از خاك هاي آلوده به نفت اطراف چاه هاي اهواز توسط گروه میکروبیولوژي دانشگاه شهید بهشتی جدا شده است. سویه R. erythropolis IGTS8 از طریق پژوهشگاه مهندسی ژنتیک و زیست فناوري فراهم گردید.
محیط کشت باکتري: - محیط Lauria Bertani - LB - شامل تریپتون 10 گرم، 10 NaCl گرم، عصاره مخمر 5 گرم در لیتر- محیط 2/44 KH2PO4 :Basal Salt Medium - BSM - گرم، 5/57 Na2HPO4 گرم، 2 NH4Cl گرم، 0/2 MgCl2,6H2O گرم، 0/001 CaCl2, 2H2O گرم، 0/001 FeCl3, 6H2O گرم و 0/004 MnCl2 گرم درلیتر کشت باکتري و جداسازي پلاسمید: باکتري رودوکوکوس اریتروپولیس IGTS8 را در محیط LB در دماي 30 °C و 200 rpm به صورت شبانه انکوبه و پلاسمید آن به روش Large Scale استخراج شد.
تکثیر اپرون :dszABC روش PCR براي تکثیر ژنهاي سولفورزدایی مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا پرایمر هاي مناسب به صورت زیر طراحی شد و طبق برنامه زیر صورت پذیرفت
جدول-:1 برنامه زمانی ژن dszABC
کلونینگ و غربالگري: قطعه ژنی 3/8 کیلوبازي بعد از هضم آنزیمی توسط آنزیم هاي ECOR Ι و Hind Ш از ژل آگارز استخراج و تخلیص گردید. سپس در سایت هاي ECOR Ι و Hind Ш که در مولتی پل کلونینگ سایت پلاسمید pVLT31 قرار دارند کلون شد. پس از الکتروپوریشن کلنی هاي رشد کرده بر روي پلیت LB-Tet تخلیص پلاسمید شدند، سپس با کمک آنزیم هاي محدود الاثر و روش PCR وجود ژن مورد نظر مورد بررسی قرار گرفت.
تست گیبس کیفی و کمی: براي تایید فعالیت پروتئین هاي DSZ A, B, C در مسیر 4S در سویه نوترکیب K. oxytoca این تست گذاشته شد. به این صورت که ابتدا باکتري به مدت یک شبانه روز در محیط LB-Tet انکوبه کرده و پلت باکتریایی به دست آمده پس از شستشو با محیط کشت BSM به 100 میلی لیتر محیط BSM که حاوي DBT 100 ppm به عنوان منبع گوگرد و 200 میکرولیتر گلیسرول به عنوان منبع کربن منتقل و در شیکر انکوباتور در دماي 30 °C و 180 rpm قرار داده شد.
هر روز یک میلی لیتر از محیط برداشته و به مدت 10 دقیقه در 6000 دور سانتریفیوژ گردید. پس از تنظیم pH نمونه ها بر روي 8 به محلول رویی 10 میکرولیتر از معرف گیبس اضافه و به مدت 30 دقیقه در دماي 30 °C انکوبه گردید و جذب آن ها در طول موج 610 - nm - خوانده شد. ظهور رنگ آبی در نمونه ها نشان دهنده حضور 2-HBP و مثبت بودن تست گییبس است
نتایج و بحث:
باکتري بومی K. oxytoca سویه اي است که از DBT و سایر ترکیبات ساده نفتی به عنوان منبع کربن استفاده نمی کند. همچنین قادر به تولید بیوسورفکتانت است که از نظر جداسازي فازي در سولفورزدایی می تواند سهم بسزایی در تسریع سولفورزدایی داشته باشد .[2] براي به دست آوردن یک سویه صنعتی لازم است اپرون سولفورزدایی تحت یک پروموتور قوي قرار بگیرد و در یک باکتري که در نفت به راحتی رشد می کند مثل سودوموناس ها و رودوکوکوس ها استفاده کرد.
در این تحقیق ابتدا اپرون dsz ABC از طریق یک پلاسمید وسیع الطیف - pVLT 31 - تحت کنترل پروموتور tac به سویه K. oxytoca کلون شد - شکل-1 ب - ، که این کلونینگ به وسیله PCR - شکل-1 ج - ، برش آنزیمی - شکل-1 د - و سپس توانایی گوگردزدایی آن در محیط BSM تایید شد. با استفاده از سولفور Bioavailability در محیط BSM بدون منبع سولفات، تست گیبس کیفی و کمی از روش هاي مهم براي تایید بیان ژن هاي گوگردزدایی و بررسی توانایی باکتري در استفاده از DBT به عنوان منبع گوگرد است. همچنین به منظور تایید تولید 2-HBP آنالیزگازکروماتوگرافی - GC - نمونه ها در حال انجام است. نتایج این آزمون با گزارش Gallardo و همکارانش در سال 1997 و Li و همکارانش در سال 2005 مطابق است.
در مطالعات گوگردزدایی، استفاده از سویه هاي بومی داراي مزیت نسبی فراوان می باشد. چون اگرچه سویه هاي متعدد حاوي اپرون گوگردزدایی در بانک ژنی موجود می باشد ولیکن حق استفاده از این سویه ها فقط براي مطالعات تحقیقاتی است و فاقد جواز استفاده تجاري می باشد.
