بخشی از مقاله
چکیده
ساکارومایسس سرویزیه داراي 20 ژن کد کننده پروتئین هاي انتقال دهنده هگزوز شامل: HXT1-HXT17، SNF3 و RGT2 می باشد که با بیان این ژن ها می توان میزان تولید الکل را طی فرایند تخمیر الکلی افزایش داد. امید است با بررسی بیشتر روي این ژن و سایر خانواده این ژن درآینده بتوان مخمر نوترکیب جهت افزایش راندمان تولید الکل طی تخمیر الکلی طراحی نمود.
در این تحقیق پس از تهیه پرایمرهاي اختصاصی قطعهاي از ژن مورد نظر با روش PCR تکثیر یافت و به همراه پلاسمید pTZ57R/T با آنزیمهاي EcoRI و HindIII به صورت انتهاي چسبان تولید گردیدند. پس از ترانسفورم pTZ57R/THXT4 به درون باکتري حد واسط اشیرشیاکلی، پلاسمید نوترکیب با روش هضم آنزیمی و نرم افزاري مورد ارزیابی قرار گرفت. ژن کد کننده پروتئین انتقال دهنده هگزوز که به وسیله Restriction Enzyme از پلاسمید pTZ57R/THXT4 جدا شده بود داراي اندازه صحیح در الکتروفروزیس ژل آگاروز می باشد .
بررسی نرم افزار نشان داد که این ژن، پروتئین با وزن مولکولی 59/840 کیلو دالتون را کد کرده و داراي 541 اسید آمینه و نقطه ایزوالکترونیک 8/3 می باشد. در این مطالعه ما ژن HXT4 را از طریق بهینه سازي PCR از ساکارومایسس سرویزیه سویه ایرانی جدا و در یک میزبان پروکاریوتیک، کلون کردیم. این اولین گزارش از جداسازي و کلونینگ این ژن از طریق مهندسی ژنتیک در ایران است که می تواند براي کلونینگ در وکتور بیانی به منظور افزایش راندمان تولید الکل طی فرآیند تخمیر الکلی به کار برده شود.
مقدمه
هزینه تولید الکل تا حد زیادي تحت تاثیر قیمت مواد اولیه قرار دارد و با انتخاب یک میکروارگانیسم کارا و در دسترس، می توان نقش مهمی در کاهش هزینه تولید ایفا نماید. اولین مرحله متابولیسم قند توسط مخمر انتقال قند از بین غشاي پلاسمایی سلول هاي مخمر می باشند - 7 و . - 6 ساکارومایسس سرویزیه داراي چندین انتقال دهنده هگزوز هستند که انتقال گلوکوز، فروکتوز و مانوز را از طریق انتشار تسهیل شده بر عهده دارند. خانواده انتقال دهنده هگزوز در مخمر شامل پروتئین هاي Gal2p، Snf3p، Rgt2p و HXT1p- HXT17p می باشند.
ژنهاي HXT الگوي بیان متفاوتی داشته و تنظیم آنها بشدت تحت ویژگی کنتیک انتقال دهنده می باشد و گلوکز اولین فاکتور کنترل کننده بیان این ژن ها میباشد. حمل کننده HXT4p الگوي بیان فوق العاده اي دارد. این حمل کننده داراي میل ترکیبی متوسطKm=10mM براي گلوکز می باشد. این ژن در سلول هاي مخمر رشد یافته در غیاب گلوکز یا در غلظت پایین گلوکز، بیان می شود.
Asano و همکاران در سال 1989 این ژن را از طریق تشکیل کتابخانه ژنومی و cDNA ، از سویه ساکارومایسس سروزیه جدا و کلون کردند - 5 و Arthur . - 3 و همکاران در سال 1990 با آزمون ساترن بلاتینگ نشان دادند که ژن HXT4 در سمت راست بازوي کروموزوم شماره XIII نزدیک سانترومر قرار دارد همچنین این ژن همولوژي بالایی را با ژنهاي RHO1 و GAL2 نشان می دهد - 2 و . - 4 ما در این تحقیق این هدف را دنبال می کنیم که ژن HXT4 را با توالی صحیح کلون کنیم و از نظر ترادف ژنی بررسی نماییم تا بتوانیم آن را در مطالعات بعدي از نظر ساختاري، فیزیولوژیکی و ایمنی شناختی مورد بررسی قرار دهیم.
اما قبل از هر کاري باید با استفاده از روش هاي مهندسی ژنتیک سیستمی طراحی کنیم تا ژن مورد نظر با طول 1621 جفت بازي را جداسازي و در مقیاس زیادتري تولید کنیم و با طراحی پلاسمید حاوي پروموتر الکل هیدروژناز امکان بیان بیشتر این ژن را فراهم کرد تا میزان تولید الکل بیشتري در طی تخمیر الکلی توسط ساکارومایسس سروزیه داشته باشیم. با انجام موفقیت آمیز این همسانه سازي می توان سیستمی را جهت ساخت پلاسمیدهاي حاوي سایر ژن هاي این خانواده معرفی و در جهت بیان این ژن ها بکار برد.
مواد و روش ها
تکثیر ژن: در بتدا ژنوم سویه ساکارومایسس سروزیه با استفاده از پروتکل استاندارد - - Haffman and Winston, 1987 استخراج شده و به منظور کپی برداري از ژن HXT4 با بکارگیري یک جفت آغازگر زیر مورد استفاده قرار گرفت - . - 1 با کمک آنزیم Taq polymerase Super از روي ژن اصل کپی برداري می شود. مواد مورد نیاز جهت ازدیاد ژن HXT4 براي reaction25 عبارت بودند از الگوي DNA ژنومیک2µl ، پرایمر رفت و برگشت هر کدام1µl و12.5µl Kit PCR master - Roche - ، آب مقطر استریل .8.5µl انجام مراحل PCR با مرحله دناتوراسیون اولیه به مدت5 دقیقه در - Hot star - 95 Cº آغاز گردید و با انجام 37 سیکل متوالی - 95 Cº به مدت 2 دقیقه 50 Cº به مدت 1 دقیقه، 72 Cº به مدت1 دقیقه و30 ثانیه - به اتمام رسید.
ترانسفورماسیون: محصول تخلیص شده ي PCR حاوي ژن HXT4 با استفاده از InsT/A Clon" product cloning kit" به داخل پلاسمید PTZ57R/T کلون شد. ترانسفورماسیون به وسیله شوك حرارتی انجام گردید. شرایط ترانسفورماسیون به این ترتیب بود: قرار دادن باکتري مستعد شده بر روي یخ به مدت 10 دقیقه، انتقال پلاسمید نوترکیب به داخل این باکتري، قرار دادن باکتري DH5α حاوي وکتور بر روي یخ به مدت 20 دقیقه، شوك حرارتی 42 Cº به مدت 55 ثانیه، اضافه کردن محیط کشت آبگوشت LB به ویال حاوي باکتري به میزان ,100μl شیکر کردن به مدت یک ساعت، سپس کشت دادن باکتري نوترکیب بر روي محیط کشت LB آگار حاوي آنتی بیوتیک آمپی سیلین، انکوبه در 37 Cº در طول شب.
نتایج و بحث
PCR، کلونینگ و آنالیز پلاسمید: DNA ژنومی مخمر به منظور تکثیر ژن - HXT4کد کننده پروتئین انتقال دهنده - با استفاده از آغازگرهاي طراحی شده H2AF و H2AR مورد استفاده قرار گرفت. تحت شرایط ایجاد شده براي انجام واکنش PCR فقط یک باندحدوداً1621 روي ژل الکتروفروز ایجاد شده است که هم اندازه ژن HXT4 است و هیچ ژن دیگري غیر از آن تکثیر نشده است. پس شرایط تکثیر تنظیم شده است و آغازگرهاي طراحی شده با نرم افزارهاي Primer preming و Fast
PCR براي تکثیر ژن HXT4 اختصاصی عمل کرداند. نتایج حاصل از الکتروفروز محصول PCR نشان داد که این ژن پس از حذف توالی کد کننده سیگنال پپتید اولیه، 1621 جفت باز طول دارد.
همچنین آنالیز هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pTZ57R/T HXT4 با آنزیم هاي EcoRI و HindIII نشان داد که ژن HXT4 به طور صحیح در کاست بیانی مورد نظر قرار گرفته است - شکل . - 2 شکل:2 باند حاصل از الکتروفروز محصول به دست آمده از عمل هضم آنزیمی با آنزیم هاي EcoRI وHind III روي پلاسمید نوترکیب استخراج شده از پرگنه سفید درون ژل آگارز یک درصد. ستون :1 مارکر، ستون :2 پلاسمید نوترکیب بریده شده مربوط به ژن پروتئین انتقال دهنده هگزوز 2، ستون :3 پلاسمید حاوي insert هضم نشده. تحقیقات اخیرنشان می دهد که تخمیر ناقص الکلی در نتیجه کاهش در انتقال گلوکز از غشاي پلاسمایی وهمچنین متابولیسم ناقص گلوکز در سلول هاي مخمر می باشد.
پس با بهبود فرآیند انتقال از غشاي پلاسمایی سلول هاي مخمر و افزایش راندمان جذب گلوکز می توان میزان تولید الکل را بهبود بخشید - . - 8 در ساکارومایسس سرویزیه جذب هگزوزهایی نظیر گلوکز و فروکتوز وابسته به انتقال دهندهاي هگزوز ویژه می باشد که این انتقال دهندها متعلق به خانواده بزرگ مونوساکاریدهاي تسهیل کننده MFS می باشند. این خانواده مولتی ژن 20 عضو دارد که تحت عنوان HXTs نامیده شده اند. اکنون پس از نتایج بدست آمده به مقایسه و ارزیابی داده هاي توالی یابی بدست آمده با داده ها و اطلاعات فوق الذکر می پردازیم.
پس از بدست آمدن توالی مذکور، براي شناخت ماهیت و کارکرد آن نخست با استفاده از ابزارهاي بیوانفورماتیکی و به طور مشخص ابزار BLASTمیزان تشابهات و مطابقت هاي توالی مورد نظر، با اطلاعات و توالی هاي موجود در بانکهاي اطلاعاتی جهانی مورد سنجش قرار گرفت که نتایج مطابقت نوکلئوتیدي انجام شد و حصول اطمینان از ماهیت آن را سبب شد.
در تفسیر نتایج بلاست انجام شده بعد از کسب یقین از صحت و ماهیت توالی بدست آمده، نکتهاي که علاوه بر آن جلب نظر میکرد تشابه 97 درصد و یکسانی 98 درصد توالی ژن انتقال دهنده هگزوز 2 با میل ترکیبی بالا براي انتقال گلوکز - - HXT4 مورد نظر جدا شده از سویه ساکارومایسس سرویزیه ایرانی با ترادف مشابه این ژن موجود در بانک جهانی ژن - - NCBI میباشد.
بررسی شباهت این ژن با سایر ژنهاي موجود در - - Genbank database NCBI نشان داد که ژن HXT4 در اکثر سویه هاي ساکارومایسس سرویزیه حفظ شده است. بررسی نرم افزار حاکی از آن بود که این ژن پروتئینی به وزن مولکولی 59/84 کیلو دالتون را کد کرده و داراي 541 اسید آمینه می باشد و همچنین داراي نقطه ایزو الکترونیک 8/3 باشد. در نهایت ما توانستیم براي اولین بار با استفاده از پلاسمیدpTZ 57 این ژن را با توالی صحیح کلون کنیم.
در این تحقیق، آنالیز توالی ژن HXT4 کلون شده در پلاسمید pTZ57R/ Tبا استفاده از سایت اینترنتی - - www.ncbi.nlm.nih.gov/blast نشان داد که قطعه 1621 جفت بازي در این پلاسمید کلون شده است. همچنین ژن کلون شده، ژن HXT4 است و ژن HXT4 این سویه ایرانی ساکارومایسس سرویزیه با ژن HXT4 سویه هاي دیگر با شماره دسترس M32270 در بانک جهانی ژن از نظر توالی 97 درصد شباهت دارد. این شباهت بیانگر این است که توالی ژن HXT4 در سویه هاي مختلف ساکاروماییسس سرویزیه به طور کامل حفظ شده است. این مطالعه راهی براي پیشرفت تولید پلاسمیدهاي نوترکیب و بیان این ژن براي مطالعه آینده است.
