بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش به منظور گروه بندي مدرن اسید فسفاتاز هاي گیاه آرابیدوپسیس بر اساس تکمیل پروژه ي ژنوم دو گیاه برنج و آرابیدوپسیس با استفاده از عبارت و بر اساس شباهت توالی ها جستجو هاي مکرري انجام شد. تعداد بسیار متنوعی از اسید فسفاتاز هاي به دست آمده بعد از هم ردیفی هاي چندگانه متعدد با استفاده از آنالیز هاي فیلوژنتیکی و بر اساس جستجوي موتیف هاي مشترك و شواهد بیوشیمیایی به 5 گروه طبقه بندي شدند.
این گروه ها داراي تکامل جدا گانه از هم در سطوح توالی و ساختار و در عین حال داراي یک همگرایی درتکامل عملکرد بودند . بررسی و مقایسه ساختار هاي مشخص در هر کدام از گروه هاي تعیین شده تنوع زیاد و دخالت موتیف هاي حفظ شده در جایگاه فعال این گروه ار آنزیم ها را تایید می کند.
مقدمه:
در دنیاي زنده، فسفر علاوه بر شرکت در ساختار DNA ، فسفولیپید ها و ناقل هاي انرژي - مانند ATP و - NADPH
در مسیر هاي تنظیمی بیوشیمیایی - مانند فسفو پروتئین ها و فسفو گلیکوزید ها - و مسیر هاي تولید انرژي - فتوسنتز - نقشی حیاتی را بازي می کند
اسید فسفاتاز ها به عنوان آنزیم هاي مهم در آزاد سازي فسفر می باشند و در حل مشکل کمبود فسفات گیاهان از کلید هاي اصلی به شمار می روند - 3،. - 4 این آنزیم ها یک نوع واکنش شیمیایی را کاتالیز می کنند، داراي تنوع بسیار زیادي هستند. این مساله طبقه بندي آن ها را دچار مشکل کرده است. تقسیم بندي هاي گذشته در مورد اسید فسفاتاز ها بیشتر بر اساس خواص بیوشیمیایی و بیوفیزیکی استوار است.
درحالی که امروزه معلوم شده که این نوع طبقه بندي داراي اشکال است. به طوري که دو پروتئینی که از لحاظ تکاملی به هم نزدیک هستند ممکن است در این طبقه بندي ها در گروه هاي جداگانه اي قرار گیرند. Babbit و همکاران در سال2001 نشان دادند که بر اساس شباهت یا عدم شباهت توالی ها نمی توان در مورد شباهت عملکرد ، ساختار و گروه بندي پروتئین ها نظري دقیق داشت و طبیعت تکامل ساختار و عملکرد پروتئین ها بسیار پیچیده تر می نماید
با توجه به دسترسی کنونی ما به داده هاي پروژه ي ژنوم براي طبقه بندي کاربردي تر پروتئین ها، آنالیز توالی ها و روابط تکاملی به همراه طبقه بندي هاي ساختاري و ویژگی هاي بیوشیمیایی روش موثرتر و داراي خطاي کمتري است.
در این پژوهش اسید فسفاتاز هاي گیاهی در سطوح توالی، ساختار، عملکرد و فیلوژنتیکی مورد بررس قرار گرفته و طبقه بندي شدند. موتیف هاي حفظ شده، در این گروه ها متفاوت بوده و به نظر می رسد تکامل هر کدام از این گروه ها مستقل از سایر گروه ها صورت گرفته باشد.
مواد و روش ها:
استخراج داده ها: براي جستجو و استخراج توالی ها هر گروه از جستجو هاي مکرر - 8 - - PSI-BLAST - در پایگاه توالی هاي پروتئینی NCBI استفاده شد. براي جستجوي ساختار هاي موجود از پایگاه PDB و 3D-NCBI استفاده شد.
به منظور استخراج دومین ها از نرم افزار Myhit استفاده شد.
همردیفی توالی ها، آنالیز فیلوژنتیکی و جستجوي موتیف: براي هم ردیفی چندگانه توالی هاي به دست آمده از الگوریتم Clustal W با استفاده از پارامتر هاي default نرم افزار استفاده شد. در بعضی از موارد با توجه به تنوع بیش از حد توالی ها براي بهینه شدن هم ردیفی تغییراتی هم درپارامتر ها و هم به صورت دستی در نتایج همردیفی ها صورت گرفت.
به منظور انجام آنالیز هاي فیلوژنتیکی از روش ME - Minimum Evolution - با آزمون Bootstrap با تکرار
1000 استفاده شد. به دلیل تنوع توالی ها در طول و محتوي از مدل pairwise deletion براي احتساب و جریمه ي gap ها در رسم درخت ها استفاده شد. تمامی آنالیز هاي اشاره شده مربوط به توالی ها توسط منوهاي مختلف نرم افزار 7 - MEGA 4.، - 5 انجام شد. به منظور تنظیم گرافیکی و نشان دادن مناطق محافظت شده در هم ردیفی هاي چندگانه ار نرم افزار BioEdit استفاده شد.
ارتباط بین ساختار اول و سوم: به منظور امتیاز دهی و تعیین مناطق محافظت شده ساختار هاي موجود براي هر کدام از گروه ها از نرم افزار - 9 - Consurf استفاده شد. نمایش، تنظیم و ویرایش نتایج حاصل با استفاده از نرم افزار Pymol - 10 - انجام شد.
نتایج:
بعد از حذف توالی هاي تکراري و ناقص، از جستجو هاي 57 PSI-BLAST توالی مربوط به گیاه Arabidopsis thaliana و 34 توالی مربوط به Oryza sativa به دست آمد. بر اساس نتایج درخت به دست آمده و نتایج همردیفی هاي چندگانه توالی هاي گیاه Arabidopsi و درخت به دست آمده چهار گروه اولیه شناسایی شد.
از توالی هاي گیاه برنج در یک آنالیز مقایسه اي براي تایید گروه بندي استفاده شد و در نهایت 5 گروه شناسایی شدند در عمل آزمون آماري Bootstrap رابطه ي فیلوژنتیکی بین اعضاي هر گروه را تایید می کرد، ولی به دلیل تفاوت بسیار بالاي توالی ها رابطه فیلوژنتیکی بین گروه هاي اصلی مشاهده نمی گردید. به منظور تعیین موتیف هاي مشترك در هر گروه، توالی هاي موجود در هر یک از گروه ها در دو گیاه ذکر شده جداگانه با توالی هاي همولوگ در سایر گیاهان و سایر ساسله ها هم ردیف شدند.
بین گروه ها موتیف مشترك دیده نشد و شباهت بین موتیف هاي توالی هاي هر گروه در تایید نتایج فیلوژنتیکی به دست آمد. نتایج آنالیز هاي Consurf جایگاه موتیف هاي حفاظت شده روي ساختار و از جمله در جایگاه فعال هر گروه را نشان داد. نتایج آنالیز هاي فیلوژنتیکی نشان داد که به جاي روابط اورتولوگی تک به تک بین توالی هاي گیاهان مختلف، روابط اورتولوگی گروهی نیز مکرر دیده می شود. با توجه به نتایج به دست آمده از آنالیز هاي بیوانفورماتیکی و نتایج حاصل از داده هاي آزمایشگاهی پنج گروه از اسید فسفاتاز ها تعریف شد که عبارتند از:
PAP - Purple Acid Phosphatese - ، - HAD superfamily Related Phosphatase - ،,HRP
HAP - Histidin Acid Phosphatese - ، - SAP - Survival Acid Phosphatase و PLP - Phospho Lipid Phosphatase -
بحث:
اسید فسفاتازها داراي تنوع زیادي هستند در حالی که در طبقه بندي هاي قدیمی تحت عنوان یک گروه مطرح می شدند و بر اساس ویژگی هاي بیوشیمیایی با زیر گروه هاي متنوعی نام گذاري می شدند. نتایج ما نشان داد که این آنزیم ها به پنج گروه جداگانه تقسیم می شوند که جد مشترك هر کدام ازگروه ها به طور جداگانه اي تکامل پیدا کرده اند.
برخی از آن ها مانند HRP ها و PLP ها بخشی ار ابر خانواده هاي بزرگ تر هستند و اسید فسفاتازهاي امروزي را تشکیل می دهند. بر خلاف این که هر کدام از گروه ها داراي مسیر تکاملی مجزایی هستند ، ولی توانایی آن ها در شکستن پیوند هاي فسفو مونو استر با روش هیدرولیز که بین همه آن ها مشترك است نشان دهنده ي نوعی تکامل همگرا بین آن ها است که ارتباط مستقیمی با اهمیت فسفر براي گیاه دارد. تعداد زیاد اسید فسفا تاز ها در دو گیاه آرابیدوپسیس و برنج نشان از مضاعف شدن هاي زیادي است که در ژن هاي اجدادي این آنزیم ها صورت گرفته است.
