پاورپوینت سنجش آنزیمی

بخشی از پاورپوینت

اسلاید 1 :

جلسه دوم و سوم درس آنزیمولوژی

سنجش آنزیمی

در جلسه اول در خصوص تعریف انزیم و اهمیت وجود ان در سلول و عملکرد آنزیم ها صحبت شد.
با توجه به اهمیت وجود انزیم و نحوه عمل آنها اندازه گیری سرعت عمل انزیم بسیار مهم می باشد فرقی نمی کند که آنزیم در سلول فعالیت نماید یا در محیط آزمایشگاهی یا در صنعت بنابراین برای این که میزان فعالیت آنزیم ها سنجیده شود در واقع باید سرعت واکنش را اندازه گیری نمود که سرعت واکنش متناسب با سرعت عمل آنزیم می باشد. که در این سنجش در واقع سرعت تبدیل سوبسترا یا ماده اولیه به محصول سنجیده می شود. برای اندازه گیری آن باید میزان سوبسترایی که مصزف شده یا میزان محصولی که تولید شده بعد از شروع واکنش را اندازه گیری نمود. انزیم های متفاوت روش های سنجش متفاوتی را با توجه به نوع واکنش کاتالیز شده و طبیعت سوبسترا یا محصول دارند.

اسلاید 3 :

در سنجش آنزیمی قابلیت آسان بودن و سریع و کم هزینه بودن مد نظر است. همچنین کیفیت، اختصاصی بودن و میزان حساسیت تست یا سنجش اهمیت دارد. برای همین باید فاکتورهایی که در سنجش آنزیمی موثر هستند را در نظر داشته باشیم.

اسلاید 6 :

فاکتورهایی که در سنجش فعالیت آنزیمی موثر هستند

1- pH محیطی که آنزیم در آن فعالیت می نماید یکی از فاکتورهای مهم در فعالیت آنزیمی است. هر آنزیم دارای یک pH بهینه یا optimum می باشد که بیشترین فعالیت را در آن دارد. و در یک طیفی از pH فعالیت دارد که خارج از آن فعالیت آنزیم کاهش یافته و حتی به صفر نیز می رسد. به عنوان مثال یک انزیمی که pH بهینه آن 7 است در طیف 5 الی 9 فعالیت دارد که بیشترین فعالیت آن در 7 است و اگر pH از 9 بیشتر یا از 5 کم تر شود فعالیت آن کاهش یافته تا این که به صفر هم می رسد.

2- دمای محیطی که انزیم د رآن فعالیت می نماید. همانند pH ، دما نیز برای آنزیم های مختلف، متفاوت می باشد. یعنی هر آنزیمی دارای دمای بهینه است و در طیفی از دما فعالیت می نماید. به عنوان مثال اگر دمای بهینه انزیمی 30 درجه سانتی گراد باشد در طیف 15 الی 50 درجه فعال است اما بیشترین فعالیت در 30 درجه می باشد و هر چه از این طیف دور می شویم یعنی از 15 درجه کمتر و از 50 درجه بیشتر فعالیت آنزیمی کاهش می یابد تا به صفر می رسد.

اسلاید 7 :

فاکتورهایی که در سنجش فعالیت آنزیمی موثر هستند

3- بافر: در واقع هیج آنزیمی در محیط خشک قادر به فعالیت نیست چه در داخل سلول و چه خارج از آن احتیاج به بافر است. آنزیم ها با توجه به ساختار و خصوصیات خود در بافر های مخصوصی قادر به فعالیت هستند و دو عامل در بافر است که باید به ان توجه شود یکی مولاریته بافر یا غلظت نمک های تشکیل دهنده آن و دیگری pH بافر که برای هر آنزیمی باید اختصاصی باشد.

4- کوفاکتورها یا فاکتورهای کمکی هم گفته می شود. این فاکتورها که از جنس غیر پروتئینی هستند (یون های فلزی دو ظرفیتی و کوانزیم ها) برای فعالیت اغلب آنزیم ها مورد نیاز هستند چه بسا که برخی از آنزیم ها بدون وجود کوفاکتور قادر به فعالیت نیستند و برخی دیگر برای افزایش فعالیت نیاز به حضور کوفاکتور در محیط دارند.

5- مهار کننده ها: همانطور که از اسمشان مشخص است عمل مهاری بر روی فعالیت آنزیم دارند که سه دسته مهار کننده از نوع برگشت پذیر داریم. رقابتی، غیر رقابتی و نا رقابتی. وجود مهار کننده ها تا زمانی که این نوع مهار کننده در محیط باشد مانع عمل انزیم و تولید محصول می شود.

اسلاید 8 :

6- سوبسترا یا ماده اولیه: میزان غلظت سوبسترا با سرعت عمل آنزیم رابطه مستقیم دارد تا جایی که سرعت به ماکزیمم برسد بعد از آن افزودن سوبسترا تاثیری بر فعالیت انزیمی نداشته و همینطور در حالت طبیعی غلظت سوبسترا باید به اندازه ای باشد که در حد Km آنزیمی باشد. یعنی در نمودار رسم شده برای سنجش فعالیت آنزیم که مطابق با نمودار میکائیلیس منتن رسم می شود باید در نیمه خط مستقیم باشد. اگر غلظت سوبسترا زیاد باشد خطا ایجاد می نماید. در نمودار زیر که نمودار میکائیلیس منتن را نشان می دهد ناحیه سرعت اولیه مشخص شده، محدوده مناسب برای غلظت سوبسترا را نشان می دهد.

اسلاید 9 :

7- اثر آلواستریک: برخی از انزیم ها برای فعالیت خود نیاز به برخی از ترکیباتی دارند که در جایگاه خاصی بر روی آنزیم نشسته که جایگاه آلوستریک نامیده می شود و فعالیت انزیم را تنظیم می نمایند. که در جلسه ای جداگانه در مورد آن صحبت خواهد شد.

8- مواد پایدار کننده: برخی مواد همانند دترجنت ها، ترکیبات احیاء کننده و نمک ها می توانند با تاثیر بر روی ساختار آنزیم بر روی فعالیت آنزیمی تاثیر گذارند. زیرا فعالیت آنزیم به ساختار سوم پروتئینی آن به خصوص ناحیه جایگاه فعال مربوط می شود.

اسلاید 11 :

فعالیت آنزیمی در برابر عواملی باید محافظت شود. همانطور که در اسلاید قبلی امده است. فاکتورهایی از جمله pH بافر باید ثابت بماند. با توجه به این که سنجش اغلب انزیم ها در عصاره انزیمی استخراج شده صورت می گیرد که حاوی انواع پروتئین های دیگر از جمله پروتئاز هاست که در دمای معمولی فعالیت می کنند و می توانند آنزیم را شکسته و غیر فعال نمایند لذا جهت نگهداری آنزیم باید در دمای پایین نگهداری شود و در دمای بالا نیز سنجش انزیمی صورت نگیرد. زیرا افزایش دما سبب پروتئولیز آنزیم می شود.

همچنین جهت مهار عمل پروتئولیز برخی از پروتئاز ها می توان از کوکتل مهار کننده پروتئازی استفاده نمود به این ترتیب آنزیم مورد نظر در برابر هضم پروتئازی محافظت می شود.

حذف عوامل احیاء کننده باندهای دی سولفیدی که در ساختار آنزیم وجود دارد. موادی همچون مرکاپتواتانل و DTT قادر به احیائ پیوندهای دی سولفیدی در ساختار آنزیم و به دنبال آن تخریب ساختار سوم انزیم و غیر فعال شدن آن می شوند اگر در ساختار آنزیم مورد سنجش واحدهای سیستئین که در پیوند دی سولفیدی شرکت می کنند وجود دارد نباید این مواد در محلول سنجش آنزیمی وجود داشته باشند.

اسلاید 12 :

وجود فلزات سنگین می تواند سبب غیر فعال شدن آنزیم شوند بنابراین می توان از ماده EDTA استفاده نمود که کلات کننده فلزات هستند البته در غلظت بسیار پایین و در صورتی که آنزیم مورد سنجش برای فعالیت خود احتیاج به یون فلزی به عنوان کوفاکتور نداشته باشد.

از استرس های مکانیکی باید دوری کرد همانند فشار بر روی محلول آنزیمی زیرا سبب تخریب ساختار سوم پروتئینی آنزیم یا به اصطلاح دناتوراسیون (denaturation) می شود.

اسلاید 14 :

سنجش فعالیت آنزیمی

همانطور که در اسلاید قبلی مشاهده کردید برای سنجش فعالیت آنزیمی باید با چند تعریف بین المللی برای آنزیم آشنا شویم.

فعالیت آنزیمی( Enzyme activity): میزان میکرومول یا نانو مول سوبسترایی که در واحد زمان ( دقیقه یا ثانیه) مصرف می شود یا میزان میکرومول یا نانومول محصولی که تولید می شود را فعالیت آنزیمی گویند. (μmol/ min)

فعالیت اختصاصی ( specific activity): میزان فعالیت آنزیم بر میزان میلی گرم آنزیم (μmol/ min.mg). زمانی اندازه گیری می شود که آنزیم مورد نظر خالص سازی شده باشد و در عصاره آنزیمی تنها پروتئین موجود آنزیم مورد نظر به صورت خالص باشد. در اینصورت غلظت آنزیم اندازه گیری شده و فعالیت به دست آمده تقسیم بر غلظت می شود.

یونیت(unit) آنزیم: واحد آنزیمی که میزان فعالیت آنزیم مورد سنجش را نشان می دهد که در صنایع و آنزیم های تجاری اهمیت ویژه ای دارد. طبق تعریف یک یونیت برابر با مقدار آنزیمی که یک میکرومول سوبسترا را در یک دقیقه تبدیل به محصول می نماید. در واقع همان سرعت عمل آنزیم در تولید محصول می باشد.

اسلاید 15 :

جهت سنجش فعالیت آنزیمی ابتدا باید یک کوکتل آنزیمی تهیه نمود که این کوکتل شامل بافر مناسب با pH و مولاریته مشخص می باشد. سوبسترا آنزیمی با غلظت مشخص و عصاره آنزیمی و اگر نیاز به کوفاکتور بود با غلظت مناسب به این کوکتل اضافه می شود. سپس برای فعالیت آنزیم، کوکتل تهیه شده در دمای متاسب و به مدت مشخصی قرار می گیرد. به عنوان مثال دمای بهیته آنزیم 40 درجه سانتی گراد است در انکوباتور با این دما و به مدت به عنوان مثال 15 دقیقه قرار می گیرد تا آنزیم فعالیت نموده و سوبسترا را تبدیل به محصول نماید سپس با ترکیبات مشخصی آنزیم را غیر فعال نموده و میزان محصول تولید شده یا سوبسترا مصرف شده سنجیده می شود که مستقیما میزان فعالیت آنزیم را نشان خواهد داد.

اسلاید 16 :

سوال این است که چطور می توان میزان سوبسترای مصرف شده یا محصول تولید شده را مشخص نمود زیرا با چشم قابل ردیابی نمی باشد. برای سنجش فعالیت یا از سوبسترای رنگی استفاده می شود که با مصرف شدن به تدریج از رنگ محلول کاسته می شود یا از سوبسترای بی رنگی که به محصول رنگی تبدیل می شود و در بعد از فعالیت آنزیمی در کوکتل رنگ تولید می شود.

برای اندازه گیری میزان عددی فعالیت آنزیمی لازم است میزان رنگ تولید شده یا کم تر شده را با دستگاه طیف سنجی اندازه گیری نمود تا میزان فعالیت آنزیمی به صورت تام به دست آید( Total activity) که متناسب با میزان جذب نوری رنگ تولید شده می باشد. دستگاه های طیف سنجی برای هر رنگی می توانند در طول موج خاصی مقدار عددی جذب نشان دهند. به عنوان مثال میزان (شدت)رنگ بنفش تولید شده در یک واکنش آنزیمی در طول موج 500 نانومتر قابل اندازه گیری است. این قسمت به طور مفصل در بخش اسپکتروسکوپی یا اسپکتروفوتومتری(spectroscopy) در درس روش های زیست شناسی توضیح داده شد. اسلاید بعدی نمودار میکائیلیس منتن مربوط به یک سنجش آنزیمی نشان داده شده است.

اسلاید 17 :

برای سنجش آنزیمی برای کسب زمان مناسب سنجش، چند کوکتل آنزیمی تهیه شده و هر کدام در یک زمان ثابت مشخص قرار داده می شود سپس میزان جذب رنگ تولید شده اندازه گیری می شود( OD) سپس نمودار رسم می گردد تا بهترین زمان عمل آنزیم به دست آید. بهترین زمان باید در محور خط راست و با OD زیر یک انتخاب شود. OD های بالای یک در نظر گرفته نمی شوند و خطای آزمایش محسوب می شود بنابراین میزان فعالیت تام آنزیمی به صورت OD/ min محاسبه می گردد.

اسلاید 18 :

در این شکل توضیحاتی که در اسلاید قبلی داده شد به صورت شماتیک مشخص شده است. هر کوکتل برای یک زمان مشخص تهیه شده است. کلمه E مخفف آنزیم و کلمه S مخفف سوبسترا هستند. Na2CO3 متوقف کننده واکنش پس از انجام آن در زمان مشخص است.

اسلاید 19 :

انواع روش های دستگاهی ردیابی سنجش آنزیمی در فلوچارت مقابل مشخص شده است. رایج ترین دستگاه های مورد استفاده که در اغلب آزمایشگاه ها موجود می باشد دستگاه طیف سنجی اسپکتروسکوپی می باشد و برای سوبسترا ها یا محصولاتی که در طول موج فلوئورسنت خوانده می شوند از دستگاه طیف سنجی فلوئورسانس استفاده می شود.