بخشی از پاورپوینت

اسلاید 1 :

بسمه تعالی

موضوع : اهمیت آزمایشهای سرولوژی در تشخیص بیماری

اسلاید 2 :

اهمیت سرولوژی

بهترین وسیله تشخیص یک بیماری عفونی جدا کردن میکروب از بیمار و مشخص کردن ان است. ولی دراکثر موارد این کار به عللی از جمله عدم مراجعه به موقع بیمار نزد پزشک مصرف داروهای ضدمیکروبی ویا مشکلات مربوط به جدا کردن کشت میکروب از بیمار بسیارمشکل میباشد وتشخیص بیماری نیز با مشکل مواجه می شود . در این گونه موارد بهترین وسریعترین راه تشخیص بیماری جستجوی انتی بادی اختصاصی ضد میکروب در سرم بیمار است . اهمیت ازمایشهای سرولوژی بیشتر در تغییراتی است که در عیار یا تیتر انتی بادی در طول مدت بیماری صورت میگیرد و پزشک میتواند از روی این تغییرات درمان بیماری را تحت کنترل داشته باشد به عبارت دیگر چنانکه تیتر انتی بادی در یک بیماری پس از مدتی که از درمان ان گذشته است درمقایسه با تیتر انتی بادی در مرحله حاد بیماری کاهش یافته باشد نشان دهنده تشخیص و درمان صحیح بیماری و برعکس افزایش تیتر انتی بادی نشان دهنده پیشرفت بیماری است ، بر همین اساس ازمایشهای سرولوژی را باید حداقل در دو نوبت به فاصله یک تا دو هفته انجام داد و تیتر انتی بادی بیمار را اندازه گیری و مقایسه نمود. این کار خصوصا در مواردی که نتیجه ازمایش مشکوک است و با وضعیت بالینی بیمار مطابقت ندارد درضروری می باشد . سن و سابقه بیمار، زمان واکسیناسیون ، وضعیت جغرافیایی ، محیط، شغل بیمار، قرابت یا تشابه انتی ژنی ، نقص سیستم ایمنی فرد ، مصرف داروها ومرحله بیماری در تفسیر ازمایشهای سرولوژی حائز اهمیت است

اسلاید 3 :

- اساس و پايه آزمايشات سرولوژي:

آزمايشات سرولوژي باليني يکي از روشهاي سريع و اسان در تشخيص بيماريها مي باشد اين آزمايشات بر اساس اتصال آنتي باديهاي اختصاصي (Specific antibody) به آنتي ژن مربوطه صورت مي گيرد. آنتي ژن مورد نظر مي تواند باکتري، ويروس، گلبول قرمز، پروتئين، هورمون يا چيزي يا چيزي ديگر باشد.
اتصال آنتي ژن به آنتي بادي يک واکنش اختصاصي، دو طرفه و برگشت پذير مي باشد و از قوانين تئوري عکس العمل بين اسيدهاي ضعيف و بازهاي پيروي مي کند.

•آنچه که بايد در رابطه با آزمايشات سرولوژيک بدانيم:

1-1-عواملي که بر واکنشهاي آنتي ژن و آنتي بادي دخالت مي کنند.
1-2-انواع واکنشهاي سرولوژيک
1-1- عواملي که بر واکنشهاي آنتي ژن و آنتي بادي دخالت مي کنند:
a- affinity يا قدرت اتصال آنتي بادي به آنتي ژن:
a2- Avidity: قدرت اتصال آنتي بادي به آنتيژنهاي پلي والان را آويديتي مي گويند

اسلاید 4 :

- PH محيط:
c- قدرت يوني محيط (ionic strength):
d_ زمان:
E_ درجه حرارت:
F_ تأثير حرکت دادن:
H_ نسبت غلظت آنتي ژن و آنتي بادي:
G_ تأثير مواد احياء کننده:
2-1- انواع واکنشهاي سرولوژيک:
طبقه بندي واکنشهاي سرولوژيک بر اساس شکل مولکولي آنتي ژن يا کار آنتي بادي و آنتي ژن انجام مي گيرد.
انواع واکنشهاي سرولوژيک بر اساس شکل مولکول آنتي ژن:
a_ واکنشهاي متراکم يا آگلوتيناسيون (Agglutination):
b- واکنشهاي رسوبي يا پرسيپيتاسيون (Precipitation):
c- واکنشهاي فلوکولاسيون (Fluccolation):
4-2-1: انواع واکنشهاي سرولوژيک بر اساس کار آنتي بادي و آنتي ژن:
1: واکنشهاي آگلوتيناسيون
2: واکنشهاي پرسيپيتاسيون
3: واکنشهاي نوتراليزاسيون
4: واکنشهاي فيکساسيون کمپلمان يا ثبوت مکمل
5: واکنشهاي ايمونوالکتروفورز

اسلاید 5 :

: واکنشهاي نشاندار با مواد فلوئورسان: (IF)
7: واکنشهاي نشاندار با آنزيم (Enzyme Immuno assay) (EIA)
8: واکنشهاي نشاندار با مواد راديو اکتيو (RIA)
9: واکنشهاي کمي لومينسانس

آگلوتيناسيون غير فعال:
اگر در آزمايش آگلوتيناسيون، آنتي بادي ناقص يا مسدود کننده باشند بعبارتي وقتي از چندين ظرفيت آنتي بادي فقط يک ظرفيت ان به آنتي ژن ذره اي متصل شود کمپلکس (ab، ag) ايجاد مي شود و شبکه کمپلکس آنتي ژن و آنتي بادي تشکيل نمي گردد فلذا آگلوتيناسيون با چشم ديده نمي شود به اين نوع واکنش مي گوييم آگلوتيناسيون غير فعال.
براي توليد شبکه کمپلکس آنتي ژن و آنتي بادي از معرف کومبس (آنتي گاماگلوبولين انساني) استفاده مي کنند که باعث تشکيل شبکه اي از آنتي ژنها و آنتي بادي گشته و آگلوتيناسيون قابل رويت مي گردد معمولاً در اين موارد کلمه کومبس به اول نام آزمايش اضافه مي کنيم مثلاً تست کومبس رايت (coombs wright)

آگلوتيناسيون پاسيو:
گفتيم وقتي آنتي ژنها محلول باشند نمي توانند آگلوتيناسيون ايجاد کنند فلذا براي ايجاد آگلوتيناسيون، آنتي ژنهاي محلول را روي ذرات لاتکس (ذراتي مثل پلي استرن و در قطرهاي 8/0 ميکرون و سايزهاي ديگر) سوار مي کنند و آنتي ژنهايي بدست مي آيد که شبيه آنتي ژنهاي ذره اي بوده و در واکنش با آنتي باديهاي اختصاصي توليد آگلوتيناسيون مي کنند که با a

اسلاید 6 :

چشم ديده مي شود به اين آگلوتيناسيون، آگلوتيناسيون پاسيو يا لاتکس آگلوتيناسيون مي گوييم مثل تست CRP_ تست RF_ تست گراويندکس

هماگلوتيناسيون:
اگر آنتي ژن ذره اي خود گلبول قرمز (Heme) باشد. آگلوتيناسيون حاصله را هماگلوتيناسيون مي گويند. مثل تعيين گروههاي خوني، مثل تست هماگلوتيناسيون براي منونوکلئوز عفوني _ تست هماگلوتيناسيون براي کيست هيداتيک
طرز تهیه سوسپانسیون 5-3% گلبول قرمز
برای اینکار ابتدا چند سی سی خون کامل (مثلاً 2-1 سی سی ) را در داخل یک لوله آزمایش ریخته و لوله را پر از سرم فیزیولوژی می کنیم و آنرا به آرامی مخلوط می کنیم.

مرحله شستشو:
1- لوله را در داخل سانتریفوژ با دور 3000 بمدت 5-3 دقیقه سانترفیوژ می کنیم
2- لوله را از سانترفیوژ برداشته با سر و ته کردن آرام لوله مایع سفید رویی را دور می ریزیم.
3- کمی سرم فیزیولوژی به لوله اضافه کرده، آنرا آرام مخلوط کرده و سپس لوله را با سرم فیزیولوژی پر می کنیم.
4- مجدداً سانتریفوژ می کنیم و از مرحله دوم به بعد را 4-3 بار تکرار می کنیم.
5- در مرحله آخر مایع رویی را دور ریخته و گلبولهای قرمز رسوب شده را به آرامی به هم می زنیم.
مرحله تهیه سوسپانسیون 5%: 5/0 سی سی از RBC شسته شده را برداشته و در داخل یک لوله بزرگ ی بشر کوچک می ریزیم و سپس روی آن 5/9 سی سی سرم فیزیولوژی اضافه می کنیم. (5/0 = 5%)

اسلاید 7 :

اگر خون شسته شده زیاد باشد می توان حجم بیشتر از سوسپانسیون را تهیه کرده مثل 95cc- RBC5cc سرم فیزیولوژی.
تعيين گروه خوني سيستم ABO:
الف_ روش مستقيم (Cell Type)
ب_ روش غير مستقيم يا معکوس (Back Typing or Revers):
الف_ روش مستقيم تعيين گروه خوني:
-يک صفحه شيشه اي (لام) يا کاشي سفيد انتخاب کرده و از خون کامل يا سوسپانسيون گلبول قرمز 50% دو قطره مجزا روي کاشي يا لام قرار مي دهيم.
-از آنتي سرم A (ويال آبي رنگ) يک قطره روي قطره خون سمت چپ اضافه مي کنيم و از آنتي سرم B (ويال زرد رنگ) يک قطره روي قطره خون سمت راست اضافه مي کنيم.
-با آپليکاتور پلاستيکي آنرا به هم مي زنيم و بعد از 2-1 دقيقه هماگلوتيناسيون را بررسي مي کنيم نتايج واکنش هماگلوتيناسيون و تعيين گروه خوني در جدول زير نمايش داده شده است.
هماگلوتیناسیون با Anti-Bهماگلوتیناسیون با Anti-A
-+گروه خونی A
+-گروه خونی B
++گروه خونی AB
--گروه خونی O

اسلاید 8 :

ب- تعيين گروه خوني بروش معکوس (Revers typing):
در اين روش از سرم (بجاي خون) براي تعيين آنتي بادي گروههاي خوني استفاده مي کنيم سپس از روي نوع از روي نوع آنتي بادي شناسايي شده نوع آنتي ژن را تشخيص مي دهيم. (نوع گروه خوني).
- ابتدا سوسپانسيون هاي 50% گروه خوني B و A را بطور جداگانه تهيه مي کنيم.
- يک لام شيشه اي يا کاشي سفيد را انتخاب کرده و دو قطره سرم فرد را بطور جداگانه روي لام قرار مي دهيم.
- سپس از روي سوسپانسيون گلبول قرمز 50% A يک قطره روي سرم چپ اضافه مي کنيم و يک قطره از سوسپانسيون 50% B را به سمت راست اضافه مي کنيم.
- با آبيليکاتور پلاستيکي آنرا به هم مي زنيم و بعد از 2-1 دقيقه نتايج هماگلوتيناسيون را بررسي مي کنيم..
- نتايج واکنش هما گلوتيناسيون و تعيين گوه خوني غير مستقيم در جدول زير نمايش داده شده است.
نوع آنتی بادی در سرمهماگلوتیناسیون با سوسپانسیون Bهماگلوتیناسیون با سوسپانسیون A
Anti-B+-گروه خونی A
Anti – A-+گروه خونی B
---گروه خونی AB
Anti-AB++گروه خونی O

اسلاید 9 :

روش تعيين Rh در لوله و آزمايش تکميلي کومبس:
1- در يک لوله آزمايش 12×75 يک قطره سوسپانسيون 50% RBC مي ريزيم (يا خون کامل)
2- يک قطره آنتي سرم D اضافه مي کنيم و بعد از 2 دقيقه آگلوتيناسيون را بررسي مي کنيم اگر مشکوک بوديم و يا آگلوتيناسيون ضعيف باشد مرحله بعد را انجام مي دهيم.
3- دو قطره آنتي هيومين گلوبولين (معرف کومبس) اضافه مي کنيم.
4- 3-4 دقيقه در حرارت اطاق و يا ℃37 انکوبه کرد.
5- با دور 1000 بمدت یک دقیقه سانتریفوژ می کنیم.
و سپس با انگشت دست به آرامی به ته لوله ضربه ملایممی زنیم و نتیجه آگلوتیناسیون را بررسی می کنیم.
آزمایش کومبس مستقیم:

هدف:
تعیین D-Anti هایی است که توسط مادر تولید شده و روی RBC جنین اتصال یافته اند. بنابراین نمونه لازم همان خون بند ناف (یا گلبولهای قرمز نوزاد) خواهد بود و این آزمایش هنگام تولد از نوزاد انجام می گیرد تا به موقع تعویض خون انجام شود.

آزمایش کومبس غیر مستقیم:

هدف:
تعیین آنتی کرهای D از سرم مادر است این آزمایش از سرم مادر در زمان قبل از حاملگی یا مراحل اول حاملگی انجام می گیرد تا مشخص شود آیا مادر در زایمان اول حساس شده یا نه.

اسلاید 10 :

آزمایش کومبس غیر مستقیم:
a- مرحله حساس کردن گلبول قرمز: ابتدا از گلبولهای قرمز گروه خونی O و Rh^+ سوسپانسیون 5% تهیه می کنیم.
1- در یک لوله آزمایش 12×100 مقدار 100 میکرولیتر سوسپانسیون فوق را میریزیم.
2- مقدار 100 میکرولیتر سرم بیمار (مادر حامله) را اضافه می کنیم.
3- بمدت 30 دقیقه در بن ماری 37 درجه سانتیگراد انکوبه میکنیم.
b- مرحله شستشو و کومبس:
4- گلبولهای قرمز حساس شده فوق را 3 بار با سرم فیزیولوژی می شوییم.
5- پس از آخرین سانتریفوژ، لوله آزمایش را برگردانده و تمام سرم فیزیولوژی را خارج کرده و آخرین قطره را با دستمال کاغذی پاک می کنیم.
6- دو قطره معرف کومبس (آنتی هیومن- گلوبولین) را به لوله فوق اضافه می کنیم.
7- 3 دقیقه در حرارت 37 درجه سانتیگراد قرار می دهیم.
8- یک دقیقه در دور 1000 سانتریفوژ می کنیم.
تفسیر: نتیجه ازمایش را با ضربه ملایم به ته لوله بررسی می کنیم. آگلوتیناسیون مثبت دلالت بر حساس بودن سیستم ایمنی بدن بیمار بر علیه آنتی ژن مذکور می باشد.
در آزمایش کومبس مستقیم از خون بند ناف یا خون نوزاد بعد از تولد استفاده کرده و از مرحله 4 به بعد را انجام می دهیم.
کاربرد آزمایش کومبس غیر مستقیم:
1- مادران Rh منفی که احتمالاً بر علیه ژنD حساس شده اند.
2- آزمایش کراس مچa

اسلاید 11 :

3- تشخیص آنتی ژن 〖RhD〗^u(تست تکمیلی Rh و کومبس)
4- تشخیص گروههای خونی kellو Duffy و kidd
5- تشخیص آنتی بادیهای ناقص یا مسدود کننده.
آزمایش رایت: Wright Test:
برای تشخیص بیماری بروسلوزیس که بنامهای دیگر نظیر تب مالت، تب مواج نیز مشهور است بکار می رود عامل بیماری شامل باکتری زیر می باشد:
1- بروسلا آبور توس B.abortus عامل بیماری در گاو
2- بروسلا ملی تنسیس B.Melitensis عامل بیماری در گوسفند و بز
3- بروسلا کانیس B. canis عامل بیماری در سگ
4- بروسلا سوئیس B. suis عامل بیماری در خوک

روشهای تشخیص سرولوژیکی بروسلوز:

1- تهیه سرم:
از بیمار خون گرفته و سرم آن را جدا نمایید. چنانچه در روز تهیه سرم، نمونه مورد آزمایش قرار نگیرد، لازم است که تا روز آزمایش سرمها را در حرارت 8-2 درجه سانتیگراد نگهداری نمود.
2- تست سریع یا آنگلوتیناسیون اسلایدی:
طبق جدول ذیل مقادیر مختلف سرم مورد آزمایش و آنتی ژن بروسلایی را در حفرات یا دوایر اسلاید شیشه ای مخصوص به وسیله پیپتهای سرولوژی اضافه نمائید. پس از اضافه کردن آنتی ژن، با آپلیکاتور از رقت پایین به رقت بالا محتوات آن را مخلوط می کنیم و بمدت 5 دقیقه در روی روتاتور حرکت دورانی می دهیم.
روش راپید:

اسلاید 12 :

شماره حفرات اسلاید 1 2 3 4 5
سرم بیمار به میلی لیتر 08/0 04/0 02/0 01/0 005/0
مقدار آنتی ژن بروسلایی یک قطره یک قطره یک قطره یک قطره یک قطره
رقت سرم 20 40 80 160 320
حدود تیتر آنتی بادی 20/1 40/1 80/1 160/1 320/1

3- تست استاندارد لوله ای:
طبق جدول مقابل مقادیر مختلف سرم فیزیولوژی، سرم بیمار و آنتی ژن را که همان آنتی ژن مورد مصرف در روش اسلایدی است با این اختلاف که قبلاً با سرم فیزیولوژی 20 بار رقیق شده است را به ده لوله همولیز تمیز (میلیمتر 100*13) به ترتیب زیر اضافه نمایید:
سپس محتویات لوله ها را مخلوط نموده و با جا لوله ای به مدت 48 ساعت در حرارت 37 درجه سانتیگراد قرار دهید و سپس با ضربه مختصری به انتهای لوله آزمایش آگلوتیناسیون را در ته لوله ها مشاهده کنید. آخرین لوله ای که آگلوتیناسیون داده باشد تیتر آنتی بادی را مشخص می کند. مثلا اگر آخرین لوله که در آن آگلوتیناسیون مشاهده شده است لوله شماره 6 باشد، تیتر آنتی بادی در سرم مورد آزمایش برابر 640/1 خواهد بود. یکی از طریق مطالعه آگلوتیناسیون برای صرفه جوئی در وقت، سانتریفوژ سریع لوله ها در 3000rpm به مدت یک دقیقه و مطالعه آگلوتیناسیون می باشد.

اسلاید 13 :

- روش انجام آزمایش رزبنگال:
آزمایش رزبنگال در منابع مختلف به اسامی رزبنگال پلیت تست، کاردتست ( Card test)، آزمون سریع یا راپید ( test) و غیره نامیده می شود. آنتی ژن رزبنگال به رنگ قرمز متمایل به صورتی و با PH اسیدی برابر با 05/0 ∓ 6/3 و به جرم نهائی 8 درصد، از کلنی های صاف (smooth) بروسلا آبورتوس سویه 99 یا 19 که فاکتورهای آنتی ژنی مشترکی با دیگر سویه های بروسلا دارند، طبق روش استاندارد بین المللی در موسسه رازی. این آنتی ژن جهت تشخیص اولیه در برنامه های کنترل و ریشه کنی بروسلوز بکار می رود. آنتی ژن رزبنگال را باید دور از نور و در یخچال چهار درجه سانتی گراد نگهداری کرد و تا زمانی که اتو آگلوتینه نشده، قابل مصرف است. قبل از انجام آزمایش باید ابتدا آنتی ژن رزبنگال و سرم بیمار را از یخچال خارج کرده و در محیط آزمایشگاه به مدت 20 تا 30 دقیقه نگهداری نموده تا به دمای آزمایشگاه برسند. سپس روی یک صفحه شیشه ای یا سفید یک قطره معادل 03/0 میلی لیتر سرم را مجاور یک قطره آنتی ژن قرار داده و با یک میله نازک چوبی یا پلاستیکی، این دو قطره را با هم مخلوط و به اندازه دایره ای به قطر حدود 5/2 سانتی متر پخش نمائید. سپس صفحه را در دست یا روی روتاتور بمدت حداکثر

اسلاید 14 :

چهار دقیقه حرکت داده و نتیجه آگلوتیناسیون را در زیر نور چراغ قرائت نمائید. واکنش مثبت به حالتی گفته می شود که دانه های آگلوتینه بطور مشخص جدا از هم دیده شوند و در موارد منفی، دو قطره مخلوط شده به حالت یکنواختی باقی خواهند ماند. در آزمایش رزبنگال موارد مشکوک دیده نمی شود و نتیجه با قاطعیت مثبت یا منفی می باشد.

تبصره 1: آ«تی ژن رزبنگال موسسه رازی را نباید رقیق کرد. در صورت رقیق کردن، خصوصیات آنتی ژن مانند تعداد ذرات میکروبی، PH و الکترولیتهای آن تغییر می کند و جوابهای مثبت یا منفی کاذب که با وضعیت بالینی هماهنگی ندارند، ایجاد می شود.

تبصره 2: آنتی ژن رزبنگال را نباید برای روش لوله ها استفاده کرد.

تبصره 3: آنتی ژن رزبنگال، نباید یخ بزند.

روش انجام آزمایش کومبس – رایت

این آزمایش برای تشخیص آ«تی بادیهای ناقص (Incomplete) یا مسدود کننده (Blocking)، خصوصاً در موارد رجعت بروسلوز یا مرحله مزمن می باشد.

1- ابتدا آزمایش رایت معمولی در لوله را مطابق دستوری که گفته شده بطور کامل انجام داده و نتایج را یادداشت نمائید.
2- سپس لوله ها را به مدت 15 دقیقه در دور 2000 در دقیقه سانتریفیوژ و رسوب آنها را جدا و سه بار با سرم فیزیولوژی بشوئید.
3- پس از آخرین سانتریفیوژ، سرم فیزیولوژی بالای رسوب را دور ریخته و آخرین قطره آنرا روی دستمال کاغذی خارج نمایند. سپس به ته نشین هر لوله یک قطره سرم آنتی گلبولین انسانس Polyspecific (سرم کومبس) اضافه کرده و لوله ها را تکان دهید.
4- لوله ها را نیم تا یکساعت در بن ماری 37 درجه سانتیگراد قرار دهید.

اسلاید 15 :

- لوله ها را بمدت 15 دقیقه در دور 2000 در دقیقه سانتریفیوژ نمائید.
6- نتیجه را با زدن ضربه آرامی به ته لوله ها بررسی و تیتر آخرین لوله ای که آگلوتیناسیون مشاهده گردید، گزارش نمائید.
روش انجام آزمایش رایت سانتریفیوژ:
روش رایت سانتریفیوژ توسط دکتر نظری و همکاران در بخش ایمونولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران پیشنهاد شده است. برای انجام این آزمایش، سرم را طبق روش معمولی رایت در لوله ها رقیق کرده و به آنها آنتی ژن بروسلا را اضافه می کنند و بلافاصله با سرعت 2500 دور در دقیقه بمدت ده دقیقه سانتریفیوژ کرده و جوابها یادداشت می شوند. با این روش اکثراً پدیده منطقه ای نیز از بین می رود.

آزمایش 2ME-Wright Test:

این آزمایش پس از مثبت شدن آزمایش رایت انجام می شود تا کلاس آنتی بادی را تشخیص داد. با این آزمایش، مولکولهای IgM سرم از بین می روند ولی IgGو IgA نسبت به مواد احیا کننده در غلظتی که استفاده می شود، مقاوم است. مواد احیا کننده، پیوندهای دو سولفیدی (-S-S-) را بصورت SH، بین زنجیره های سنگین و سبک ایمونو گلبولین باز می کند. مهمترین کاربرد این آزمایش، تشخیص افتراقی بین بروسلوز فعال از غیر فعال در فردی که تظاهرات بالینی بیماری را ظاهراً دارد ولی کشت خون یا سایز نمونه ها، عاری از میکروب بروسلا و تیتر آزمایش رایت او نیز پائین است. بعلاوه با انجام این آزمایش می توان تأثیرر آنتی بیوتیک مناسب را در درمان بیماری تحت بررسی قرار داد.

اسلاید 16 :

محلولهای مورد لزوم:
1- تامپون یا بافر فسفات نمکی PBS=7.2 محتوی 1/0 مولار 2- مرکاپتواتانول ( محتوی 1/0 مولار 2- مرکاپتواتانول (2-ME)یا بافر فسفات نمکی محتوی 005/0 مولار 1 و 4- دی تیوترئیتول (DTT). از آنجایی که 2-ME بوی زننده ای دارد و باید در زیر هواکش یا هود (Hood) کار کرد، بنابراین اگر در آزمایشگاهی هود موجود نیست می توان از DTT استفاده کرد. بهتر است است تامپون 2- مرکاپتواتانل در روز آزمایش آماده شود و درب آن محکم بسته شده تا تبخیر و غیر فعال نگردد.
2- آنتی ژن بروسلا، سرم و سایر محلولهائی که برای این آزمایش بکار می روند باید فاقد فنل باشند، زیرا که فنل از کار مواد احیاء کننده (2-مرکاپتواتانل و دی تیوئیتول) جلوگیری می کند. در صورتی که آنتی ژن محتوی فنل باشد باید قبل از آزمایش چند بار آنرا با بافر فسفات نمکی شستشو داد.

روش کار:

1- تعداد 10 از لوله آزمایش سرولوژی را در جا لوله ای ممناسب قرار دهید. (جدول شماره 3-6).
2- مقدار 9/00 سانتی متر مکعب بافر فسفات نمکی محتوی ماده احیا کننده را در لوله آزمایش اول بریزید.
3- مقدار 1/0 سانتی متر مکعب سرم بیمار را به لوله اول آزمایش اضافه نموده و سر لوله را با کاغذ پارافیلم مسدود نمائید.
4- لوله اول را بمدت یکساعت در درجه حرارت اطاق یا 37 درجه سانتی گراد قرار داده و مواد احیا کننده اثر خود را نموده و باعث تجزیه و غیر فعال شدن IgM گردد.

اسلاید 17 :

پدیده منطقه ای یا پره زون:
در صورتی که غلظت آنتی بادی بیشتر از آنتی ژن باشد واکنش انجام نمی گیرد و احتمال جواب کاذب در لوله های اول وجود دارد که در تست رایت دیده می شود.

ب- روش اگلوتیناسیون سریع: Rapid Plate Agglutination Test

روی شیشه پاک و تمیزی بکمک خط کش و مداد شمعی حدود 64 مربع به ابعاد 5/1*5/1 سانتی متر می کشیم سپس با استفاده از پی پت 1/0 میلی لیتر و یا سمپلر (Sampler) مقادیر 08/0، 04/0، 02/0، 01/0، 005/0، 002/0 میلی لیتر از سرم خون بیمار را در شش خانه افقی ریخته و یک قطره از آنتی ژن مورد نظر را به آنها اضافه می نمائیم.
مخلوط آنتی ژن و سرم را توسط اپلیکا تور چوبی بخوبی بهم می زنیم. شاهد نیز یک قطره آنتی ژن در خانه هفتم است شیشه را چندین بار تکان داده و نتیجه آزمایش را بعد از یک دقیقه به شرح ذیل ثبت می نمائیم.
100% اگلوتیناسیون با علامت (++++)، 75% اگلوتیناسیون با علامت (+++)، 50% اگلوتیناسیون باعلامت (++)، 25% اگلوتیناسیون با علامت (+) و بالاخره اگلوتیناسیون منفی با علامت (-) مشخص می شود. (تابلوی شماره 2).
لازم به یادآوری است که در روش اگلوتیناسیون سریع چند نکته زیر را باید مد نظر داشت.
1- تیتراژ برابر است با عکس بالاترین رقتی که با مقایسه شاهد حداقل 50% (++) اگلوتیناسیون از خود نشان دهد.
2- بعد از اضافه نمودن آنتی ژن مقادیر 08/0 تا 02/0 میلی لیتر از سرم خون به ترتیب معادل 1/20، 1/40،1/80،1/160،1/320،1/640 رقت خواهد شد.

اسلاید 18 :

- در این روش باید به محدودیت زمانی توجه خاصی نمودوضمن آزمایش نبایدشیشه الگوتیناسیون را نزدیک حرارت قرار دادکه هر دوصورت مقداری آب تبخیرگشته و نتیجه ای صحیح حاصل نمیگردد.
تابلو( 2)نمونه ثبت نتیجه در روش اگلوتیناسیون سریع

اسلاید 19 :

مقدارسرم
(ml)رقت مشابهشدت اگلوتیناسیون نمونه اولنمونه دومنمونه سوم
8%1:20**********
4%1:40*********
2%1:80******
1%1:160-***
005/01:320-*-
002/01:640--
تیتر سوم4016080

ج- روش اگلوتيناسيون لوله
اين روش که براي کليه نمونه سرمهاي مکشوک مورد استفاده قرار مي گيرد به مراتب حساس تر از روش اگلوتيناسيون سريع بوده و صرفا به وقت و لوازم آزمايشگاهي بيشتر نياز دارد.
روش آزمايش:
1-تهيه رقت آنتي ژن: در آزمايش ويدال ابتدا آنتي ژن سالمونلاي مورد نظري که براي آزمايش به روش آگلوتيناسيون سريع استاندارد گرديده را با محلول سرم فيزيولوژي فرمله (5/0% ) به نسبت⅛ رقيق مي نمائيم. در مورد آزمايش رايت ووايل فليکس بايد از آنتي ژني (بروسلا آبورتوس و پروتئوس ولگاريس) که براي آزمايش به روش لوله استاندارد گرديده استفاده نمود.

اسلاید 20 :

2-روش کار : تعداد ده لوله (10*100) را در جا لوله اي قرار داده و در لوله اول 9/0 و در کليه لوله هاي بعدي 5/0 ميلي ليتر سرم فيزيولوژي (9/0 در صد) مي ريزيم به لوله اول 1/0 ميلي ليتر سرم مورد آزمايش را اضافه نموده و بعد از مخلوط نمودن آنها بوسيله پي پت، 5/0 ميلي ليتر از آنرا به لوله دوم و 5/0 ميلي ليتر از لوله دوم را به سوم و به ترتيب تا لوله نهم انتقال مي دهيم ضمنا 5/0 ميلي ليتر مايع اضافي لوله نهم را دور مي ريزيم. به هر يک از لوله ها 5/0 ميلي ليتر از آنتي ژن رقيق شده و يا استاندارد شده براي روش لوله را اضافه نموده و بعد از بهم زدن به شرح زير در گرمخانه قرار مي دهيم.

آنتي ژنهاي فلاژلا سالمونلاها به مدت يک ساعت در 50 درجه و يا سه ساعت در 37 درجه سانتيگرد.
آنتي ژنهاي سماتيک سالمونلاها به مدت 16 ساعت در 50 درجه و يا 24 ساعت در 37 درجه سانتي گراد.
آنتي ژن بروسلا آبورتوس (لوله) به مدت 24 تا 48 ساعت در 37 درجه سانتي گراد.
آنتي ژنهاي پروتئوس ابتدا به مدت 2 ساعت در 37 درجه سپس 16-18 ساعت در 4 درجه سانتي گراد.
بعد از زمان اينکوباسيون، بوسيله نور فلورسنتي که در زمينه سياهي بتابد درجه آگلوتيناسيون را با مقايسه شاهد (لوله دهم که داراي 5/0 ميلي ليتر آنتي ژن است) طوري ثبت مي نمائيم که علامت (++++) مشخص کننده صد در صد اگلوتيناسيون آنتي ژن با آنتي کر باشد يا بعبارت ديگر هنگاميکه در ته لوله آگلوتيناسيون به خوبي مشاهده گرديده و مايع لولهمانند سرم فيزيولوژي کاملاً شفاف باشد.

در متن اصلی پاورپوینت به هم ریختگی وجود ندارد. برای مطالعه بیشتر پاورپوینت آن را خریداری کنید