بخشی از مقاله
بررسي مورفولوژي و رشد سلول هاي رنگدانه دار شبکيه ي انسان بر لايه ي نازکي از آلژينات به عنوان بستر
چکيده : در اين تحقيق ازآلژينات به عنوان بستري براي رشد سلول هاي اپيتليال رنگدانه دار شبکيه استفاده شد. بدين منظور آلژينات سديم ٦ درصد ساخته شده و در هر خانه از ظروف ٦ خانه اي رقت هاي متفاوتي از استوک اوليه ريخته شد. سلول هاي RPE بر سطح اين بستر ها کشت داده شد، و اثر آن بر مورفولوژي سلول ها بررسي شد. براي مقايسه از کشت سلول هاي RPE بر سطح پلي استيرن استفاده شد. سلول ها بر روي بستر الژينات به صورت کلوني مشاهده شدند که بعد از ٩ روز هنوز زنده بودند و بعد از جدا شدن و کشت دوباره آنها بر سطح پلي استيرن ، مورفولوژي سلول ها تغير کرد، آنها بتدريج از کلوني ها جدا شدند و به سطح ظرف چسبيدند.
کلمات کليدي: مهندسي بافت ، آلژينات ، سلول هاي اپيتليال رنگدانه دار شبکيه
مقدمه : مهندسي بافت برپايه ي ايجاد داربستي مي باشد تا بتواند شرايط همانند ماتريکس خارج سلولي ( ECM )درون بدن را براي سلول فراهم کند. ترکيبات پيچيده و طبيعت ديناميک ماتريکس خارج سلولي امکان شبيه سازي دقيق آن را مشکل مي کند. نقش اين ماتريکس ايجاد بستر مناسب براي رشد و تکثير سلول ها و ارتباط سلول به سلول و سلول به محيط است . پس بايد داربست خارج سلولي مصنوعي بتواند جزئي از فعاليت هاي ECM را شبيه سازي کند.(١)
قرار دادن سلول ها در محيط دو بعدي اطلاعات مهمي به ما مي دهد اما به نظر مي آيد که اين سلول ها در درون بدن از يک محيط سه بعدي پيچيده بهره مي گيرند. براي ساختن داربست ها، پليمرهاي سنتزي و طبيعي وجود دارند. آلژينات از جمله پليمرهاي طبيعي است که منشا آن ديواره جلبک هاي قهوه اي و جلبک هاي قرمز است .(٢)
آلژينات نقش بستري سه بعدي را براي سلول فراهم مي کند تا ماتريکس خارج سلو لي را براي انسان شبيه سازي کند و از متابوليسم و عملکرد سلول حمايت کند. ساختار متخلخل آلژينات امکان تبادل گلوکز و الکتروليت ها و مواد غذايي و اکسيژن را براي سلول فراهم مي کند . ترشحات و ترکيبات زايد از آلژينات خارج مي شود . آلژينات ايجاد پاسخ التهابي و ايمونولوژيک نمي کند (٣) . آلژينات به دليل ارزاني ،کاربرد آسان در تشکيل هيدروژل با هدف ايجاد ساختار سه بعدي شبيه ماتريکس سه بعدي ،عدم سميت و زيست سازگاري به طور گسترده در تحقيقات براي کشت سلول مورد استفاده قرار مي گيرد(٤).
سلول هاي رنگدانه دار شبکيه (RPE) به صورت لايه اي اپيتليالي مي باشند که سلول هاي فوتورسپتور مخروطي و استوانه اي بر روي آن قرار دارد و نقش حمايت و غذادهي به اين سلول ها را برعهده دارند.(٥)
با توجه به اين که از دست رفتن عملکرد سلول هاي RPE يا سلول هاي عصبي شبکيه در بيماري هاي مختلفي رخ مي دهد امروزه ضروريت جايگزيني اين سلول ها با سلول هاي کارا و سالم بسيار مورد توجه است . تحقيقات نشان مي دهد که بستر الژينات توانايي رشد و تمايز سلول هايRPE را دارا مي باشد (٦) .
در اين تحقيق قصد داريم بستري مناسب از آلژينات براي سلول هاي RPE بسازيم و رشد سلول ها را بر آنها بررسي کنيم .
مواد و روش ها:
تهيه ي بستر: از پليمرآلژينات سديم محلول هاي ١% ، ٢% و ٣% در آب دوبار تقطير و DMEM.F١٢ تهيه شده و از آن درهر خان ه از ظرف ٦ خانه ٨٤٠ ميکروليتر ريخته شد تا ضخامتي حدود ١ ميلي متر از بستر پديد آيد. ظرف ٦ خانه به مدت ١٠ دقيقه در ٧٠ - قرار گرفت . بر سطح سخت آن کلريد کلس يم Mm١٠٠ ميريزيمريخته شد و . بعد از ٥ دقيقه کلريد کلسيم خارج ش ده و با آب دوبار تقطير بستر شسته شده و بر روي سطح آن DMEM.F١٢ ريخته شد تا اثر اسيدي کلريد کلسيم به خوبي خارج ش ده و به مدت ١٦ ساعت در انکوباتور́̈ ٣٧ وCO٢ %٥ قرار گرفت .
کشت سلول هاي RPE: سلول هاي RPE انساني از پاساژ ٣ از فريز بازيابي گرديد .به اين منظور فلاسک مورد نظر با
FBS پوشيده شده و به مدت ٢ ساعت در انکوباتور قرار گرفت . سپس حجم مناسبي از DMEM.F١٢ به آن اضافه شد تا غلضت نهايي ٢٠% FBS به دست آي . سپس سلول ها از ازت مايع خارج گرديده و بلافاصله در آب c٣٧ قرار داده شد تا سلول ها کاملا باز شوند سپس سلول هاي باز شده به فالکن ml١٥ حاوي ٢ الي ٣ ميلي ليتر DMEM.F١٢ انتقال داده شده و به مدت ٥ دقيقه در g٣٠٠ سانتريفيوژ شده و به فلاسک آماده شده انتقال يافت .
کشت سلول ها بر روي بستر الژينات : بعد از دوبار پاساژ سلول هاي باز يابي شده از فريز، يک فلاسک با جمعيت مناسب از سلول هاي پاساژ ٦ تريپسينه شده رسوب سلولي در ml١ از DMEM.F١٢ سوسپانس شد و شمارش آن بوسيله لام هموسايتومتر وبا کمک ميکروسکوپ نوري Carl ZEISS محاسبه شد.
به هر خانه از ظرف ٦ خانه ١٠٠ هزار سلول اضافه شد به گونه اي که در هر خانه ml٢ از DMEM.F١٢ به صورت FBS%١٠ وجود داشته باشد.
بررسي مورفولوژي سلول ها روي بستر: در روز هاي بعد سلول هاي روي بستر با کمک ميکروسکوپ فاز کنتراست بررسي شد و تغيرات مورفولوژي در آنها و ميزان چسبندگي آنها نسبت به بستر پلي استيرن مشاهده و گزارش شد.
بررسي ميزان زنده ماندن سلول ها بر روي بستر: در روز هاي بعد، از سلول هاي کشت شده بر روي بستر کشت هاي دوباره اي انجام شد تا زنده ماندن سلول ها بر روي بستر بررسي شود. براي اين منظور در هر خانه از ظرف ٦ خانه FBS ريخته و ظروف به مدت ٢ ساعت داخل انکوباتور قرار داده .شد براي اين کار از سطح بستر ٥٠ ميکروليتر محيط حاوي کلوني برداشته و بر ظرف حاوي ml٢ از DMEM.F١٢ داراي ١٠ % FBS افزوده شد. و تغيرات مورفولوژي سلول ها را در روز هاي بعد با کمک ميکروسکوپ فاز کنتراست ZEISS Axiovert٢٥ بررسي گرديد.
