بخشی از مقاله
مقايسه ي تأثير داربست هاي آلژينات و کيتوسان - ژلاتين در توليد ماتريکس خارج سلولي در سلول هاي نوکلئوس پالپوزوس ديسک بين مهره اي
چکيده
مقدمه : يکي از مهم ترين علل کمر درد، تخريب ديسک بين مهره اي (Intervertebral disc يا IVD) است . تخريب IVD در اثر کاهش تعداد سلول ها و کاهش توليد و تخريب ماتريکس خارج سلولي (Extracellular matrix يا ECM) بافت IVD به خصوص در ناحيه ي نوکلئوس پالپوزوس (Nucleus pulposus يا NP) ايجاد ميشود. در مهندسي بافت از داربست هاي طبيعي و غير طبيعي مختلف براي ترميم و بازسازي IVD استفاده ميگردد. اگرکان يکي از پروتئوگليکان هاي مهم در بافت NP ديسک مي باشد. هدف اين مطالعه ، مقايسه ي ميزان ترشح اگرکان توليدي توسط سلول هاي NP در IVD انساني در دو داربست آلژينات و کيتوسان - ژلاتين بود.
روش ها: سلول هاي NP با تجزيه ي آنزيمي کلاژناز از بافت NP بيماران مبتلا به فتق IVD در بيمارستان الزهراي (س ) اصفهان تهيه گرديد. محلول کيتوسان با محلول ژلاتين مخلوط شد. مخلوط حاصل پس از Freeze drying، به عنوان داربست مورد استفاده قرار گرفت . داربست آلژينات نيز تهيه گرديد. سوسپانسيون سلولي حاوي سلول هاي NP جداشده ، به دو داربست منتقل و تا ١٤ روز کشت داده شد. براي بررسي ميزان ترشح اگرکان از تکنيک ELISA و براي بررسي مورفولوژي سلول ها نيز از ميکروسکوپ نوري استفاده شد.
يافته ها: ميزان ترشح اگرکان از روز ٣ تا ١٤ به صورت معني داري افزايش داشت . مقايسه ي ميزان ترشح در دو داربست آلژينات و کيتوسان - ژلاتين نشان داد که اختلاف معنيداري بين دو داربست در روزهاي ٧ و ١٤ کشت وجود داشت ، ولي در روز ٣ کشت اين اختلاف معن دار نبود. با توجه به نتايج ، ميزان ترشح ماتريکس خارج سلولي توسط سلول هاي نکلئوس پالپوزوس در داربست آلژينات نسبت به داربست کيتوسان -ژلاتين اختلاف معنيداري داشت .
نتيجه گيري: داربست آلژينات نسبت به داربست کيتوسان - ژلاتين محيط مناسب تري براي ترشح ECM توسط سلول هاي NP انساني در In vitro فراهم ميکند و پيشنهاد ميشود ازاين داربست براي کشت سلول هاي NP در In vivo استفاده گردد.
واژگان کليدي: ديسک بين مهره اي، مهندسي بافت ، کيتوسان ، ژلاتين ، آلژينات ، اگرکان
مقدمه
ديسک بين مهره اي (Intervertebral disc يا IVD) از خارج به داخل شامل ٢ منطقه ي حلقه ي فيبري (Annulus fibrosus يا AF) و نوکلئوس پالپوزوس (Nucleus pulposus يا NP) که هسته ي مرکزي ژلاتيني ديسک را ميسازد، است (١). AF و NP به طور عمده از ماتريکس خارج سلولي (ECM يا Extracellular matrix) تشکيل شده اند. IVD و به خصوص بافت NP تعداد سلول هاي کمي دارد و ١ درصد حجم بافت ديسک را تشکيل ميدهد (٢). ECM در NP شامل : آب ، کلاژن نوع ٢، هيالورونان و پروتئوگليکان ها ميباشد. اگرکان يکي از پروتئوگليکان هاي مهم و از فراوان ترين پروتئوگليکان در
ECM ميباشد. پروتئوگليکان ها، خاصيت آبکي و ويسکوالاستيکي به ديسک ميدهند که سبب جذب شوکهاي وارده ، حفظ الاستيسيته ي ديسک و محافظت در برابر نيروهاي وارده به ديسک ميشوند (٣).
يکي از اتفاقات بافتي بدن در اثر افزايش سن ، دژنره شدن IVD است که در آن ، تعداد سلوهاي بافت و ميزان توليد ECM کاهش مييابد و در نهايت سبب تغيير در ساختار و عملکرد بافت مورد نظر ميشود (٤). بنابراين سلول درماني راه حل مفيد و مؤثر براي ترميم IVD ميباشد؛ چرا که خطرات ژن درماني و مولکول درماني را ندارد (٦-٥).
در مطالعه اي که توسط Nishimura و Mochida انجام شد، مشخص گرديد که تزريق سلول هاي NP بافت اتولوگ به ديسک دژنره شده سبب کاهش دژنراسيون در IVD ميشود (٧). همچنين تمايز سلول هاي Mesenchymal stem cells( MSC) به سلول هاي NP و انتقال آن ها با داربست آلژينات ، سبب افزايش توليد ECM توسط سلول هاي NP و ترميم ديسک آسيب ديده ميشود (٨).
انتخاب داربست مناسب به عنوان محيطي براي رشد، تکثير، توليد و ترشح ECM، يکي از اصول اساسي در مهندسي بافت و سلول درماني محسوب مي شود. داربست مورد استفاده بايد ويژگيهاي منحصر به فردي داشته باشد. به عنوان مثال بايد زيست تخريب پذير، زيست سازگار و داراي منافذ مناسب با تخلخل کنترل شده باشد (١٠-٩).
آلژينات يک بيوپلمير طبيعي است که به طور عمده از جلبک قهوه اي و به ميزان کمتر از باکتريها استخراج ميشود (١١). مطالعات نشان داده است که آلژينات سبب افزايش تکثير، تمايز و ترشح ECM توسط کندروسيت هاي کشت داده شده بر روي اين داربست ميشود (١٢).
Stevens و همکاران با کشت سلول هاي NP بر روي داربست آلژينات گزارش کردند که داربست آلژينات سبب تکثير بيشتر سلول هاي NP و افزايش ترشح ECM توسط اين سلول ها ميشود (١٣).
همچنين برخي مطالعات نشان داده اند که سلول هاي جدا شده از IVD انسان و خرگوش ، پس از کشت بر روي داربست آلژينات ، کلاژن نوع ٢، اگرکان و گليکوزآمينوگليکان هاي بيشتري ترشح ميکنند (١٤).
از ديگر داربست هاي پر کاربرد و بيوپليمري در مهندسي بافت ، کيتوسان مي باشد. کيتوسان پليمر گليکوزآمين و N استيل گليکوزآمين است که از دپلاريزاسيون و د-استيلاسيون کيتين به دست ميآيد (١٦-١٥). خاصيت کاتيوني کيتوسان آن را به عنوان داربست جذاب و مفيدي تبديل کرده است که براي اگرکان توليدي کندروسيت ها، که خاصيت آنيوني دارند، بسيار مفيد است و يک محيط سازگار براي کندروسيت ها ايجاد ميکند (١٨-١٧).
کيتوسان از لحاظ زيست سازگاري و زيست تخريب پذيري بسيار مناسب است و ساختاري شبيه گليکوزآمينوگليکان هاي ECM در غضروف دارد .(17-18)
در بسياري از مطالعات از کيتوسان به عنوان داربست در ترميم استخوان و غضروف (٢٠-١٩)، سيستم عصبي (١٩)، ترميم پوست (٢١) استفاده شده است .
طبق تحقيقات انجام شده بر روي تأثير داربست کيتوسان در تکثير سلول هاي NP و ميزان ترشح ECM، نتايج نشان داد که اين نوع داربست باعث افزايش تکثير سلول هاي NP و ترشح ECM ميشود .(22-23)
در مهندسي بافت از روش هاي متعددي براي افزايش استحکام داربست ها استفاده ميشود. افزودن ژلاتين و Freeze drying دو روش بسيار مناسب براي افزايش استحکام داربست ميباشد (٢٥-٢٤).
ژلاتين بيوپليمر طبيعي است که از هيدروليز کلاژن به دست ميآيد. زيست سازگاري، زيست تخريب پذيري و تحريک نکردن سيستم ايمني از خصوصيات خوب ژلاتين محسوب ميشود (٢٦).
مطالعات نشان داده است که افزودن ژلاتين به داربست کيتوسان ، سبب افزايش خاصيت هيدروفيليکي کيتوسان ميشود (٢١). همچنين به عنوان جزء اصلي ECM نيز محسوب ميشود (٢٧). نتايج مطالعات نشان ميدهد که داربست کيتوسان - ژلاتين در تکثير سلول هاي بنيادي پالپ دندان بسيار مؤثر است (٢٤).
داربست کيتوسان - ژلاتين ، ساختار شبکه اي مناسبي براي رشد و تکثير سلول ها، در مقايسه با کيتوسان خالص فراهم مي کند (٢٩-٢٨).
با توجه به اهميت داربست هاي بيوپليمري پر کاربرد آلژينات و کيتوسان در ترشح ECM که جزء اصلي يک بافت زنده محسوب ميشود و نيز اين که در بررسي متون ، مطالعه اي که تأثير دو داربست آلژينات و کيتوسان - ژلاتين در ترشح ECM توسط سلول هاي NP در IVD انساني را بررسي و مقايسه کرده باشد، يافت نشد؛ هدف اين مطالعه ، مقايسه ي تأثير داربست هاي آلژينات و کيتوسان - ژلاتين در توليد ECM در سلول هاي NP در IVD انساني بود.
روش ها
براي انجام اين مطالعه ، کيتوسان (با درجه ي د-استيلاسيون ٨٥ درصد)، ژلاتين و آلژينات از کمپاني سيگماي آمريکا خريداري شد. براي تهيه ي داربست کيتوسان - ژلاتين ، گرد کيتوسان در اسيد استيک ٠.٢ مولار حل شد تا محلول کيتوسان ١.٥ درصد (نسبت وزن بر حجم ) با ٤.٤ = pH به دست آمد. گرد ژلاتين نيز در آب غيريونيزه (Analar water)
حل و محلول ژلاتين ٠.٥ درصد ساخته شد. سپس کيتوسان ١.٥ درصد با محلول ژلاتين ٠.٥ درصد به نسبت حجمي ١:١ مخلوط گرديد. مخلوط کيتوسان - ژلاتين در ديش ١٠ سانتيمتري ريخته شد. ضخامت مخلوط در ديش ٤ سانتي متر بود. پس از آن ، ديش در فريزر در دماي ٢٠- درجه ي سانتيگراد به مدت ٢٤ ساعت قرار گرفت . در نهايت به مدت ٣٦ ساعت Lyophilized شد.
براي تهيه ي داربست آلژينات ابتدا پودر آلژينات در محلول ٠.٩ درصد NaCl حل و محلول آلژينات ١.٢ درصد ساخته شد. سپس محلول فيلتر گرديد.
براي جدا کردن سلول هاي NP ابتدا قطعات بافتي از مرکز NP در IVD افرادي که تحت جراحي فتق IVD قرار گرفته بودند، استخراج گرديد. سپس اين قطعات بافتي به قطعات کوچک تري خرد شد و در محلول Hank's Balanced Salt Solution( HBSS) (Gibco BRL) با آنتيبيوتيک پنيسيلين - استرپتومايسين (سيگماي آمريکا) قرار گرفت .
با قرار دادن قطعات سلول هاي NP در محلول آنزيمي محتوي کلاژناز نوع ١ (٠.٢ درصد) به مدت ٤ ساعت در دماي ٣٧ درجه ي سانتيگراد، قطعات بافت NP تجزيه شد. بافت هضم شده به مدت ١٠ دقيقه با دور ١٨٠٠ دور در دقيقه سانتريفوژ شد.
سوسپانسيون سلولي در ظروف کشت که حاوي DMEM.F12، ٥٠ واحد در ميليليتر پنيسيلين - استرپتومايسين (سيگماي آمريکا) و ٢٥ ميکروگرم ال - آسکوربيک اسيد (سيگماي آمريکا) بود، کشت داده شد. ظروف کشت در انکوباتور، در دماي ٣٧ درجه ي سانتيگراد با CO2 ٥ درصد قرار گرفتند.
براي انتقال سلول هاي NP به داربست کيتوسان .ژلاتين ، داربست هاي کيتوسان - ژلاتين تهيه شده به قطعات ٥ ميليمتري با ضخامت ٤ ميليمتر بريده شدند و به پليت ٢٤ خانه انتقال يافتند و با اشعه ي Ultraviolet( UV) به مدت نيم ساعت استريل گرديد.
سلول هاي NP انساني در پاساژ اول کشت مونولاير با تريپسين ، تريپسينه و سانتريفوژ شدند.
حجم ١٠٠ ميکروليتر از سوسپانسيون سلولي محتوي ١٠٥ × ١ سلول ، با پيپت به داربست کيتوسان - ژلاتين انتقال داده شد.
براي انتقال سلول ها به داربست آلژينات ، به رسوب سلولي که محتوي ١٠٥ × ١ سلول بود، محلول آلژينات اضافه شد. اين محلول به صورت قطره قطره ، توسط سرنگ ٢٢ Gage، به هر خانه از پليت ٢٤ خانه که حاوي محلول کلريد کلسيم ١٠٢ ميليمولار بود، اضافه گرديد. پس از ١٥ دقيقه حباب هاي آلژينات سلولي به صورت هيدروژل در آمدند و با محلول NaCl به مدت ١٠ دقيقه شستشو انجام گرفت . سپس بيدهاي واقع در خانه هاي پليت ٢٤خانه با مديوم شستشو داده شد. پس از شستشو با مديوم ، مديوم F١٢ (شامل FBS ده درصد و پنيسيلين - استرپتومايسين ) به هر خانه اضافه شد و در نهايت پليت ها به انکوباتور منتقل گرديدند و تا ١٤روز کشت داده شدند. هر ٣ روز يک بار مديوم تعويض ميگرديد.
رنگ آميزي تريپان بلو بر روي نمونه هاي آلژينات طبق پروتکل مقالات انجام گرديد. به طور خلاصه قطره هاي آلژينات با PBS دو بار شستشو داشته شدند و سيترات سديم به پليت حاوي قطرات اضافه شد.
سانتريفوژ با دور ١٦٠٠ دور در دقيقه به مدت ١٠ دقيقه انجام گرفت . سپس ١٠ ميکروليتر از سوسپانسيون سلولي برداشته شد و با ١٠ ميکروليتر رنگ تريپان بلو بر روي لام مخلوط گرديد.
در مرحله ي بعدي، هموسايتومتر به زير ميکروسکوپ معکوس انتقال داده شد و شمارش سلولي صورت گرفت .
رنگ آميزي تريپان بلو براي نمونه هاي کيتوسان - ژلاتين مانند رنگ آميزي نمونه هاي آلژينات انجام شد با اين تفاوت که براي جدا کردن سلول ها از داربست کيتوسان - ژلاتين ، از تريپسين EDTA استفاده شد.
مقدار اگرکان در مايع رويي محيط هاي کشت در روزهاي ٣، ٧ و ٢١ طبق پروتکل کيت (Invitrogen) Human aggrecan direct ELISAتعيين شد. به طور خلاصه ، مايع رويي به عنوان آنتي ژن به پليت ELISA اضافه شد و مولکول هاي اگرکان که با آنتيباديهاي پوشش داده شده رقابت ميکنند، اضافه گرديد تا آن ها به آنتي ژن ها اتصال داده شوند و ساندويچ تشکيل گردد. سرانجام سوبستراهاي آنزيمي اضافه شدند و جذب مخلوط در طول موج ٤٥٠ نانومتر به وسيله ي اسپکتروفتومتر اندازه گيري شد.
براي مقايسه ي ميزان ترشح ECM سلول هاي NP در داربست هاي آلژينات و کيتوسان - ژلاتين ، داده هاي به دست آمده توسط نرم افزار آماري SPSS نسخه ي ١٧ (Chicago, IL ,SPSS Inc. ,١٧ version) و آزمون Mann-Whitney مورد مقايسه و آناليز آماري قرار گرفت .
يافته ها
سلوهاي NP کشت داده شده در محيط کشت مونولاير در ابتدا بسيار کوچک و نواري شکل بودند (شکل ١).
شکل ١. سلول هاي نوکلئوس پالپوزوس در کشت مونولاير در پاساژ صفر
نواري شکل بودن و کوچک بودن سلول ها در اين شکل مشهود است (٦٠ ×).
در پاساژهاي بالاتر اين سلول ها به اشکال فيبروبلاستي با زوايد بلند تغيير يافتند (شکل ٢).
در داربست آلژينات ، سلول ها با مورفولوژي گرد يافت شدند (شکل ٣).
شکل ٢. سلول هاي نوکلئوس پالپوزوس در کشت مونولاير در پاساژ اول و دوم
شکل فيبروبلاستي با زويد بلند سلول ها واضح است (٦٠ ×).
شکل ٣. در اين تصوير قطره ي کروي شکل ژل آلژينات (Bead) ديده ميشود.
سلول هاي نوکلئوس پالپوزوس با مورفولوژي کروي شکل در منافذ ژل آلژينات قرار دارند (٦٠ ×) نتايج شمارش سلول ها که توسط رنگ آميزي تريپان بلو انجام شد، نشان داد که ميانگين تعداد سلول ها در هر دو داربست آلژينات و کيتوسان - ژلاتين ، در روز ١٤ نسبت به روز ٧ کاهش معني داري داشت و اين کاهش در داربست کيتوسان - ژلاتين به صورت معنيداري بيشتر از داربست آلژينات بود (شکل ٤).
بر اساس نتايج آزمايش ELISA، ميانگين مقدار اگرکان ترشحي سلول هاي NP در داربست آلژينات نسبت به داربست کيتوسان - ژلاتين افزايش معنيداري داشت و اين افزايش در روز ٧ و ١٤ نسبت به روز ٣ بيشتر بود (شکل ٥).
