بخشی از مقاله
*** این فایل شامل تعدادی فرمول می باشد و در سایت قابل نمایش نیست ***
بررسی زیست سازگاری فیلم های پلی وینیل الکل گرافت شده با ‐N وینیل پیرولیدون جهت تهیه غضروف مصنوعی
چکیده:
در سالهای اخیر با افزایش فعالیتهای ورزشی و همچنین افزایش تصادفات رانندگی ، صدمات وارد برغضروف افزایش یافته است. با توجه به اینکه عبور مواد غذایی و اکسیژن رسانی در غضروف ازطریق مایع سینوویال انجام میگیرد، عملاﹰ رگها در اکسیژن رسانی نقشی ندارند ، بنابر این ترمیم غضروف به سختی انجام گرفته و بهمین علت امروزه مبحث مهندسی بافت غضروف بطور گسترده ای مطرح شده است تا بتوان با ایجاد غضروف مصنوعی و جایگزینی آن بجای غضروفهای معیوب این عیب را مرتفع نمود . در این تحقیق فیلمهای پلیمری از ۰۱% پلی وینیل الکل (PVA) بعنوان پایه اصلی فیلمها تهیه گردید. به منظور ایجاد ساختاری متخلخل و مشابه با غضروف طبیعی از دو روش استفاده شد. در روش اول به منظور ایجاد تخلخل مقدار ۰۱% گلیسرول به محلولPVA اضافه شد و سپس برای افزایش خواص مکانیکی ، نمونه ها تحت عملیات آنیلینگ قرار گرفتند . در روش دوم برای تهیه فیلمهای متخلخل PVA از روش Freeze-thaw استفاده گردید.سپس با توجه به خواص زیست سازگاری و جذب آّب بالای – N وینیل پیرولیدون، سطح کلیه فیلمها با استفاده از پرتودهی توسط اشعه گاما با – N وینیل پیرولیدون گرافت شد و سپس زیست سازگاری نمونه ها توسط تستهای زیست سازگاری مورد آزمایش و بـررسی قرار گرفـت.
نتـایج حاصل از آزمایش نشان مییدهد که با افـزایش مـیزان گرافـت نمـونه ها تا ۸۳% زیـست سـازگاری اقزایش مییابد.
واﮊه های کلیدی :پلی وینیل الکل _ وینیل پیرولیدون _غضروف مصنوعی _زیست سازگاری
١‐ مقدمه:
بافت غضروفی یک بافت همبند نیمه جامد قابـل انعطـاف است که استحکام و انعطاف غضروفها بستگی به ترکیبات ماده بنیادی آنها دارد. در ماده بنیادی غضروف ، یعنی در فضای بین سلولی غضروفها، گلیکو پروتئین بویژه مقدار زیادی پلی ساکاریدسولفاته وجود دارد.در داخل ماده بنیادی غضروف، اگر رشته های کلاﮊن کم باشد ، غضروف شفاف و اگر رشته های کلاﮊن زیاد باشد، غضروف فیبری خوانده میشود و چنانچه در ماده بنیادی، رشـته ارتجـاعی زیـادی وجـود داشـته باشـد ، غضـروف ارتجـاعی نامیـده میشود.]١[
۱‐۱‐ ساختار و ترکیب غضروف:
غضروف مفصلی از تعدادی سلول کندروسـیت و همچنـین یک زمینه خارج سـلولی تشـکیل شـده اسـت . ۵۷% وزن غضروف را آب تشکیل میدهد و از ۵۲% در صد باقیمانـده، حدود ۰۷% وزن خشک را الیاف کلاﮊن تشـکیل مـی دهـد که در حقیقت مقاومت کششی غضـروف ناشـی از حضـور رشته های کلاﮊن می باشد و بقیه آن را پروتئوگلیکـان هـا تشکیل می دهند ].٢[
١‐٢‐ انواع عیوب غضروف :
عیب غضروف معمولا یا به شکل chondral اسـت یـا بـه شــکل osteochondral انــواع عیــوب دیگــری کــه در غضروف دیده میشود ، ناشی از شکاف در غضروف میباشد. عیب chondral را عیب ضـخامت جزئـی، نمـی توانـددر استخوان subchondral نفوذ کند و در نتیجه بـه آرامـی کارایی خود را از دست میدهد.
Osteochondral یا عیب ضخامت کلی در کل لایه های غضروف نفوذ کرده و به استخوان subchondral می رسد تا به عروق دسترسی پیدا کند. در نتیجه وقتی عیب بصورت خودبخودی بهبود می یابد که به استخوان subchondral نفوذ میکند. بنابراین عیوب ضخامت جزئی به راحتی عیوب ضخامت کلی قابل ترمیم نیستند.یک تئوری در رابطه با این عیب چنین است که ترمیم عیب ضخامت جزئی منحصرا به کندروسیتهای کناری تکیه دارند .اما کندروسیتهای همسایه نمیتوانند پاسخگوی نیاز ترمیم غضروف باشند و چون در عیب ضخامت جزئی، عیب نمی تواند به لایه های subchondral برسد ، سلولهای mesenchymal مغز استخوان قادر نیستند به منطقه بافت کلسینه شده نفوذ کنند و در عیب وارد شوند، در نتیجه بازسازی غضروف متوقف میگردد. درصورتیکه سلولهای mesenchymal قادر باشند در منطقه غیر استخوانی سطح غضروف وارد شوند، ممکن است به شکل الیافی در بافت ظاهر گردندو از لحاظ بیو شیمیایی و بیو مکانیکی با غضروف شفاف متفاوت باشد غضروفهای فیبری از لحاظ ظاهر شبیه غضـروفهای شـفاف هستند ولـی از لحاظ سلولی و پرتئـوگلـیکانها متفاوت می باشند.این غضروفها استحکام بالایی دارند در نتیجه تخریب و از بین رفتن آنها ممکن است در اثر تـنش هـای بـالا در بافت بهبود یافته و باز سازی شـده باشـد]۳[ پـس بـدین ترتیب ترمیم عیوب غضروفها بصـورت خودبخـودی بسـیار سخت انجام میگیرد.] ۴[
شکل ۱ _ تصویری ازعیب ضخامت جزئی یا عیب chondral و عیب ضخامت کلی یا عیب osteochondral
۱‐۳‐ مهندسی بافت غضروف :
با توجه به اینکه ساختار غضروف به شکلی است که عبـور مواد غذایی و اکسیژن رسانی در غضـروف از طریـق بافـت مایع یا مـایع سـینوویال انجـام میگیـرد و عمـلا رگهـا در اکسـیژن رسـانی نقشـی نـدارد و از طرفـی چـون نسـبت کندروسیتها به زمینه سلولی و تقسیم سلولی کـم اسـت و همانـا بعلـت کـم بـودن سـرعت عملکـرد در غضـروف در مقایسه با سایر بافتها، ترمیم و باز سـازی غضـروف بـه کندی انجـام میگیـرد و بهمـین جهـت در سـالهای اخیـر مبحث مهندسی بافت غضروف بطـور گسـترده ای مطـرح گردیده است . درمانهای معمول برای بهبود عیوب غضروف بصـورت پیونـد غضـروفی ، ایمپلنـت گـذاری غضـروفهای مصنوعی و استفاده از اسکافولد است. در این زمینـه مـواد طبیعی و مصنوعی بسیاری جهت تهیه غضـروف مصـنوعی بکار میرود.
مواد طبیعی قابل تخریب شامل اسفنج های کلاﮊنی و ﮊلها گلیـــو آمینـــو گلیکـــان هـــا((GAG و هیالورنیـــک اسید((HA،مواد طبیعی غیر قابل تخریب شامل آگاروس، مواد مصنوعی تخریب شونده مثل پلی استر، پلی لاکتیـک اسید، پلی گلیکولیـک اسـید، ویکریـل،داکرون و بعضـی از پلی یورتانها. مواد مصنوعی غیـر قابـل تخریـب مثـل پلـی وینیل الکل، فیبرهای کربنی و تفلون. شـرایط لازم بـرای اینکه ماده ای بتواند بعنوان غضروف مصـنوعی بکـار بـرود عبارت است از:
۱‐ روغن کاری خوب ٢‐ قابلیت جذب شوک مناسب ٣‐ سازگاری خوب
٤‐ چسبیدن محکم به استخوان زیرین ٥‐ مقاومت سایشی بالا]۴[
هیدروﮊلها با خواص منحصر بفردشان یکی از مطرحترین مواد در زمینه تولید غضروف مصنوعی میباشد . هیدروﮊلها پلیمرهای با خواص آبدوستی بالا می باشند که وقتی در داخل آب قرار میگیرند، مقدار زیادی آب جذب کرده و متورم میشوند اما تحت این شرایط شکل خود را از دست نمیدهند.]۵[ در میان هیدروﮊلها، هیدروﮊل پلی وینیل الکل با خواص مخصوص خود ، بیومتریال مناسبی است که شرایط لازم را جهت تهیه غضروف مصنوعی دارا میباشد. هیدروﮊل پلی وینیل الکل تقریبا از لحاظ میزان آب مشابه غضروف طبیعی است ولی ضریب اصطکاک کمتری داردکه مزیت بزرگی برای روغنکاری مفاصل است
. از طرفی بررسی زیست سازگاری هیدروﮊل نشان میدهد که بعد از مدت ۲۵‐۸ هفته بعد از ایمپلنت گذاری، هیچگونه تخریب یا تورمی در غضروف مفصلی یا اطراف غشاﺀ سینوویال مشاهده نمیشود.] ۶[
۲‐ مواد و روشها :
۲‐۱‐ آماده سازی فیلمهای پلی وینیل الکل با
افزودن گلیسرول و انجام عملیات حرارتی آنیلینگ:
غضـروف طبیعی دارای تخـلخـل های پیوسته و متصل می باشد که تغذیه سلولها از طریق این تخلخل ها صورت میگیرد . بنابراین فیلم مورد نظر باید دارای تخلخل باشد و برای ایجاد تخلخل های منظم در این مـاده از روشهای مختلفی استفاده میشود. ] ۷و۸[ یکی از روشهای استفاده شده بکار بردن گلیسرول می باشد.]۹[ برای تهیه فیلم متخلخل پلی وینیل الکل از گرانولهای PVA ساخت شرکت مرک آلمان و با درجه هیدرولیز ۰۹% استفاده شد.
برای تهیه محلول ۰۱%PVA ، گرانولهای PVA را در آب مقطر در دمای ۰۹ درجه سانتیگراد حل نموده سپس محلول توسط همزن مغناطیسی مخلوط می گردد.
برای ایجاد تخلخل در نمونه، به محلول ۰۴ – ۰ % وزنی گلیسرول اضافـه میگردد . مخـلوط بدسـت آمـده درون پتریدیش پلاستیکی به قطر ۸ سانتی متر ریخته شده و به مدت ۴ روز در دمای ۰۵ درجه سانتی گراد قرار داده میشود تا نمونه ها کاملا خشک شوند.
نمونه های حاصل را پـس از خشک شـدن به مدت یک ساعت در دمای ۰۲۱ درجه سانتی گراد در آون خلا قرار داده تامراحل آنیلینگ وکریستالیزاسیون انجام گیرد]۰۱. [
بعد از انجام عمل آنیلینگ فیلمهای بدست آمده بمدت ۸۴ ساعت در متانول با دمای ۷۳ درجه سانتیگراد قرار میگیرند تا گلیسرول از داخل شبکه خارج گردد .سپس نمونه های حاصل در هوا خشک میشوند.]۹[
۲‐۲ آماده سازی فیلمهای پلی وینیل الکل با انجـام عملیات :Freeze-thawing
برای تهیه نمونه های Freeze-thaw (F-T) شده، ابتدا گرانولهای PVA ساخته شده در شرکت مرک آلمان با درجه هیدرولیز ۰۹% را در داخل آب ریخته ، در دمای ۰۹ درجه سانتی گراد توسط همزن مغناطیسی ، محلول ۰۱% پلی وینیل الکل تهیه مینماییم .پس از آماده سازی محلول ، نمونه ها داخل ظرفهایی با قطر ۸ سانتی متر قرار گرفته و سپس تحت سیکل های مختلف انجماد و ذوب قرار میگیرد . نمونه ها در ۳ سیکل متوالی بمدت ۰۹ دقیقه در دمای ۵۲‐ قرار گرفته و سپس در دمای محیط برای مدت ۰۶ دقیقه باقی می مانند تا عمل ذوب انجام گیرد.پس از پایان عملیات ، نمونه ها در محیط قرار گرفته تا کاملا خشک شوند.]۱۱[
۲‐۳ پرتـو دهـی ‐N وینیـل پیرولیـدون بـر روی فیلمهای پلی وینیل الکل توسط گاما:
یکی از روشهای متداول برای انجام عمل پیونـد زنـی یـک مونومر بر روی سـطح پلیمـر دیگـر ، روش پیونـد زنـی از طریق اشعه گاما می باشد.]۲۱[ برای انجام این کار نمونـه هایی را با ابعاد Cm ۱/۰ x ۴ x ۱ از فـیلم پلـی وینیـل الکل بریده و داخل ویال های اسـتوانه ای قـرار میـدهیم .
برای تهیه محلول پیونـد زنـی ،محلـول ۰۹ % وزنـی از آب مقطرو ۰۱% وزنی پلی وینیل الکل و مونـومر – N وینیـل پیرولیدون تهیه مینماییم. محلولهای که تهیه نمـودیم بـه شرح زیر می باشد:
جدول ۱: نمونه ها برای مدت ۴۲ ساعت در داخل محلول حاصل قرار داده می شود که این مساله به افزایش میزان پیوند خوردگی کمک میکند. ]۳۱ و۴۱[
بدین ترتیب مونومرها میتواننـد در داخـل شبکه ها وارد شـده و پرتو دهی بهتر انجـام گیـرد . نمونه هـای حـاصل برای جلـوگـیری از پلـیمریزاسیون در یـخچال نگـهداری میشوند . نمونه های آماده شده در داخل دستگاه گاما سل قرار گرفته و برای انجـام پـرتـو دهـی تـو سـط اشعه گاما ( 60Co) تحت دزهای تابشی ۵ و ۰۱ و ۵۱ KGy پرتو دهی میشوند . پس از عملیات پرتو دهی نمونه ها توسط آب مقطر شسته شده و بـه مـدت ۸۴ ساعت در داخـل آب مقطرغوطـه ور میشوند تا کلیه هموپـلیمرهای ایجاد شده در سطـح جدا شوند . سپس نمونه ها در محیط هوا خشک میشوند.
۲‐۴‐ محاسبه و اندازه گیری میزان درجه پیوند خوردگی:
برای بررسی میزان پیوند خوردگی – N وینیل پیرولیدون بر روی سـطح پلـی وینیـل الکـل از رابطـه زیـر اسـتفاده میگردد:
فرمول (۱) :
Wg, W0 به تر تیب وزن نمونه خشک پرتو دهی نشـده و وزن نمونه خشک پرتو دهی شده می باشد. بدین ترتیب میزان و درصد گرافت – N وینیـل پیرولیـدون را بـر روی سطح فیلم PVA محاسبه مینماییم.]۵۱[
۲‐۵‐ آماده سازی محیط کشت:
به منظور بررسی زیست سازگاری مواد مورد استفاده در پزشکی روشهای مختلفی وجود دارد که یکی از این روشها کشت سلولی می باشد . انتخاب روش کشت وابسته به کاربرد خاص ماده مورد نظر می باشد بعنوان مثال برای بررسی زیست سازگاری عروق مصنوعی از پلاکتها و سلولهای اندوتلیال استفاده میشود .
در این تحقیق برای انجام کشت سلولی و بررسی زیست سازگاری ماده ساخته شده بعنوان غضروف مصنوعی از استاندارد ASTM- F813 استفاده شد. بر اساس این استاندارد سلولهای مورد استفاده برای انجام کشت سلولی، سلـولـهای فیبرو بلاسـت بافـت همبند موش با معرفه L-929 بودند. این سلولها از قسمت تحتانی زیر شکم موش استخراج میشوند و تعدادشان بسیار زیاد است.(تعداد آنها در هر ویال ۶۰۱ x ۸/۳ می باشد.)اما سرعت رشد و تکثیر آنها کند است و وجود کمترین باکتری و قارچ در محیط کشت موجب مرگ این سلولها می گردد.
برای کشـت و تکثیـر ایـن سـلولها بایـد از محـیط کشـت مناسب استفاده شود. محیط کشت مـورد اسـتفاده بـرای این سلولها RPMI و سرم جنینی گاوی (FBS) بود.
روش آماده سازی محیط کشت بدین صورت می باشد کـه سلولهای فیبرو بلاست در داخل محیط کشت قرار میگیرد
. سـپس فلاسـک مربوطـه در داخـل انکوبـاتور CO2 بـا مشخصات زیر قرار میگیرد:
Biotech, Galaxy standard , England ,99% relative humidity, 4-6 % CO2 , t=37°c
سلولهای فیبرو بلاست ، تحت چنین شرایطی تکثیر میشوند سلولهای مربوطه برای رشد و تکثیر خود از محیط کشت تغذیه میکنند بهمین دلیل محیط کشت مورد استفاده بعد از چند روز قابلیت خود را از دست میدهد .
به این منظور تعویض محیط کشت اصطلاحا ٌمی باید پاساﮊ سلولی انجام بگیرد . ]۶۱[ برای این کار محیط کشت قبلی را از زیر هود استریل خارج کرده و سپس ۳‐۵ میلی لیتر محیط کشت به آن اضافه میکنیم و دوباره آنرا در داخل انکوباتور قرار میدهیم . در صورتیکه این سلولها به صورت شناور در داخل محیط کشت باشند ، می بایست ابتدا محیط قبلی سانتریفوﮊ و سپس تریپسینه شوند(منظور از تریپسینه کردن افزودن تریپسین به فلاسک میباشد) با انجام مراحل فوق سلولها تکثیر یافته و برای انجام کشت سلولی بر روی نمونه های مورد نظر آماده می گردند.
۲‐۶‐ کشت سلولی :
برای انجام کشت سلولی مراحل زیر با استفاده از استاندارد ASTM- F813 به شرح زیر انجام گرفت:]۷۱[
۱) ابتدا نمونه هایی به شکل دایره با قطر ۲۱ میلـی مترتهیه و توسط الکل ۶۹% اسریل شد.
٢) سپس نمونه ها در داخل plate های ۴۲ تـایی
قرار میگیرد نکته مورد توجه این است کـه دمـای مـواد و ظرف و بطور کلی دمای محیط کشـت یکسـان و برابـر بـا دمای بدن (۷۳ درجه سانتی گراد) میباشد.
٣) برای هر plate بـه قـدر کـافی محـیط کشـت (سرم جنینی گاو ۰۱% ( RPMI + بهمراه آنتی بیوتیک و ضد قارچ اضافه شد تا باکتری های موجود در محـیط اثـر خود را ازدست دهند.
٤) ســلولها را تریپســنه کــرده و سوسپانســیونی از سلولها تهیه میکنیم . تعداد سلولها حـدودا ٌ میباشد که به هر ظرف اضافه میشود.
5 - نمونه های تهیه شده بمـدت ۸۴‐۲۷ سـاعت در انکوباتور° c ۲ ± ۷۳ با ۵% ۲ CO و ۰۹% رطوبت قرار میگیرد.
٦ - برای مقایسه نمونـه هـای کشـت شـده از کنتـرل منفی و مثبت استفاده شـد. کنتـرل منفـی آن اسـت کـه واکنش سلول با آن قابل صرفنظر کـردن باشـد. در اینجـا ماده مورد نظر برای کنترل منفی در یکی از ظرفها محیط کشت بدون نمونه ریخته شد و از سلولهای ته نشین شـده بر کف ظرف (که از جـنس پلـی اسـتایرین بـود) بعنـوان کنترل منفی استفاده شد وهمچنین بـرای تهیـه کنتـرل مثبت از لاتکس اسـتفاده شـد . نمونـه هـا بـا اسـتفاده از میکروسکوﭖ نـوری بـا بزرگنمـایی ۰۰۲ برابـر مشـاهده و بررسی گردید.
٧) برای رنگ کاری نمونه ها ابتدا نمونه ها را ازمحیط کشت خارج کرده و نمونـه هـا را توسـط الکـل تثبیـت و سپس رنگ آمیزی میکنیم.برای این کار سطح نمونه ها را با الکل اتیلیک ۰۵ % پوشانده و به مدت ۰۲ دقیقه نمونه ها را در این حالت قرار داده سپس الکل را خارج کـرده و از الکل ۰۷ % استفاده نموده و ۰۲ دقیقـه در ایـن حالـت نگه میداریم و سپس نمونه ها را توسط الکل ۶۹% تثبیـت کرده و بعد از ۰۲ دقیقه آنرا خارج نموده و سپس نمونه ها را توسط محلول ۰۲% رقیـق شـده گیمسـا در آب مقطـر بمدت ۰۲ دقیقه رنگ آمیزی کرده و سپس نمونه ها را بـا آب مقطـر شســته و سـپس توســط میکروسـکوﭖ نــوری ارزیابی میکنیم.
۲‐۷‐ نتایج آزمون کشت سلولی :
از آنجاییکه چسبندگی سلول فیبرو بلاست به سطح مـاده نشانه زیست سازگاری سطح می باشد ، با انجام آزمایشات کشت سلولی و بررسی سطوح مختلف نتایج قابل تـوجهی حاصل گردید
در این روش مطـابق اسـتاندارد ASTM F813 ارزیـابی نتایج بدست آمده بر اساس مقایسه با یـک نمونـه کنتـرل مثبت و یک نمونه کنترل منفی انجام میشود.کنترل منفی نمونه ای است که سازگاری خوبی با سلولها دارد و سلولها به خـوبی روی آن نشسـته ومراحـل کامـل رشـد را طـی میکند. کنترل مثبت نمونه ای است که سمیت آن محـرز است و موجب مرگ سلولها می شود . این دو نمونه کنترل باید همـواره بـا نمونـه هـای مـورد آزمـایش و در شـرایط یکسان با آنها کشـت داده شـود. شـکل ۲ و ۳ دو کنتـرل منفی و مثبت کشـت شده بـا نمونـه هـای مـورد نظـر را نشان می دهد. در تصویر کنترل منفی رشد خوب سـلولها کاملا مشهود است. فرایند رشدسلول روی یـک سـطح بـا درصدهای گرافـت متفـاوت در اشـکال زیـر آمـده اسـت.
تصاویر، زیست سازگاری بسیار خوب آنها را نشان میدهند.
شکل ۲‐ شاهد منفی نمونه ها
شکل ۵‐ میزان چسبندگی سلولهای فیبرو بلاست بر روی
