بخشی از مقاله
خلاصه
در این مطالعه پلیمر طبیعی کیتین از پوست میگو صید شده از خلیج فارس طی فرآیندهای املاح زدایی و پروتئین زدایی استخراج و سپس با استفاده از سوسپانسیون آن و پلیمر کیتوسان به نسبت 1 به 1 داربست به روش خشک کردن انجمادی در دمای -50 درجه سلسیوس و فشار 0/1 میلی بار تهیه شد. به منظور بررسی تخلخل سطح و همچنین به هم پیوستگی منافذ داربست تهیه شده، از میکروسکوپ الکترونی استفاده شد. افزون بر این برای بررسی زیست سازگاری داربست، سلولهای مزانشیمی انسانی روی آن کشت داده شد و توسط آزمون MTT زندهمانی سلولها در روزهای 1، 5، 7، 14بررسی شد.
.1 مقدمه
کیتین یکی از فراوانترین پلی ساکاریدهای موجود در طبیعت و بعد از سلولز فراوانترین زیست پلیمر موجود در طبیعت است و کاربرد بسیار زیادی درزمینهی زیست فناوری، کشاورزی و پزشکی دارد 1]و.[2 مهمترین منبع مواد خام برای استخراج کیتین پوست سختپوستان است، که از این بین پوست خرچنگ و میگو از اهمیت ویژهای برخوردار است 2]و .[3در حالی که حدود 65 تا 70 درصد از میگو دور ریخته میشود که این مقدار شامل پوست، سر و باقیمانده گوشت آن است و تنها 30 درصد آن مورد استفاده قرار میگیرد بنابراین مقدار بسیار زیادی از پوست میگو روزانه تولید شده و میتواند به منظور تولید کیتین مورد استفاده قرار گیرد 4]و.[5 پوست میگو علاوه بر کیتین حاوی املاح، پروتئین و چربی است به طوری که حدود 14 تا 30 درصد پوست میگو را کیتین تشکیل میدهد و به منظور خالصسازی کیتین، این مواد از پوست میگو حذف میشوند.
برای حذف املاح و پروتئین از روشهای متداول املاح زدایی و پروتئین زدایی استفاده می-شود 5]و.[6 در طبیعت 3 نوع کیتین شناسایی شده است: آلفا-کیتین، بتا-کیتین و گاما-کیتین که در این بین آلفا-کیتین فراوانترین گونهی شناخته شده است .[7] در چند دهه اخیر کیتین به دلیل زیست سازگاری، فعالیت ضد میکروبی و زیستتخریبپذیری بسیار مورد توجه قرار گرفته است 4]و.[7 از جمله مواردی که از کیتین به عنوان ماده اولیه داربست استفاده میشود داربست برای بازسازی نقص استخوانی است 8]و.[9 همچنین در بسیاری از مقالات از کیتین و یا مشتقات آن به عنوان مادهی هدایت کننده به سمت استخوان استفاده شده است .[9] یکی از اساسیترین قسمتهای مهندسی بافت استخوان، ساخت داربستهای زیست-سازگار و زیست تخریبپذیر است.
در حال حاضر، داربستهایی برای تشکیل بافت استخوان و رگزایی طراحی شدهاند که ویژگی مشترک اغلب این داربستها، متخلخل بودن و تشکیل شدن از مواد زیست سازگار و زیست تخریبپذیر است. بنابراین با توجه به ویژگیهای نامبرده، داربست از جنس کیتین میتواند بستر مناسبی را برای بارگذاری عوامل رشد، دارو-ها، ژنها و سلولها فراهم کنند .[8] از طرفی یکی از چالشهای اصلی در زمینه مهندسی بافت استخوان، تهیهی داربستهای زیست سازگار و زیست تخریبپذیر با اندازه منافذ مناسب و استحکام مکانیکی کافی برای بهبود چسبندگی، رشد و تمایز سلولهای استخوانی است، که در این مطالعه تخلخل و همچنین زیست سازگاری داربست بررسی میشود.
.2 مواد و روشها
در این مطالعه پوست میگو از میگوهای صید شده از خلیج فارس و همچنین هیدروکلریک اسید 37 درصد و سدیم هیدروکسید از شرکت مرک آلمان تهیه شد. کیتوسان از شرکت ACROS و با وزن مولکولی متوسط تهیه شد. همچنین محیط کشت سلولی DMEM از شرکت CMG و FBS از شرکت GIPCO تهیه شد. از کوره الکتریکی ABTIN مدل AFL18 مجهز به ترموکوپل با غلاف سرامیکی برای حرارت دادن نمونهها استفاده شد. به منظور بررسی زندهمانی از کیت MTT که از شرکت SIGMA تهیه شده بود، استفاده شد و همچنین از دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل STATE FAX 2010 استفاده شد. از دستگاه خشک کن انجمادی مدل ALPHA1-2/LD به منظور تهیه داربستها استفاده شد.
.1-2 استخراج کیتین
پوست میگو تهیه شده در -21 درجه سانتیگراد نگهداری و به آزمایشگاه انتقال داده شد، سپس بعد از ذوب شدن، به مدت 24 ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد برای خشک شدن قرار داده شد. وزن پوست میگو خشک شده حدود 100 گرم به دست آمد. مقدار 25 گرم پوست میگو در 150 میلیلیتر هیدروکلریک اسید 1 نرمال ریخته شد و به مدت 5 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد هم زده شد. سپس پوست باقیمانده با آب مقطر به منظور خنثی کردن pH شستشو داده شد و سپس در دمای 85 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت خشک شد. به منظور پروتئین زدایی از محلول سدیم هیدروکسید استفاده شد. پوست میگو به دست آمده از مرحله قبل در محلول 3 نرمال سدیم هیدروکسید و به مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس مقدار باقیمانده پوست میگو با آب مقطر به منظور خنثی شدن pH شستشو داده شد.
.2-2 تهیه داربست
برای تهیه داربست از روش خشک کردن انجمادی و برای دو ماده کیتوسان خالص و مخلوط کیتین و کیتوسان استفاده شد. به این صورت که محلول کیتوسان 2 درصد با استفاده از حل کردن 2 گرم کیتوسان در 100 میلیلیتر محلول 1 درصد استیک اسید به دست آمد. سپس به وسیله محلول یک نرمال سدیم هیدروکسید pH محلول کیتوسان به حدود 6/5 افزایش یافت. برای تهیه محلول کیتین/کیتوسان 1 گرم کیتوسان در محلول 1 درصد استیک اسید حل شد و 1 گرم کیتین سنتز شده به آن اضافه شده سپس pH محلول توسط محلول 1 نرمال سدیم هیدروکسید به 7/2 افزایش یافت. هر دو محلول به مقدار مساوی در پلیتهای 48 خانه ریخته شد و توسط دستگاه خشک کن انجمادی مدل ALPHA1-2/LD در دمای -50 درجه سانتیگراد و فشار 0/1 میلیبار به مدت 24 ساعت خشک شد.
.3-2 ریخت شناسی داربست
بهمنظور بررسی دقیق شکل ظاهری و ساختار فیزیکی داربستهای تهیه شده از جنس کیتوسان و کیتین/کیتوسان و نیز ارزیابی اندازه منافذ و میزان تخلخل آنها، از تصویرهای تهیه شده از نقاط مختلف داربستها توسط دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی استفاده شد. داربستهای تهیه شده پس از پوششدهی با لایه نازکی از طلا، به وسیله میکروسکوپ الکترونی مورد بررسی قرار گرفتند. شکل ظاهری، میزان تخلخل و همچنین میانگین مساحت منافذ آنها به دست آمد. میانگین مساحت منافذ، توسط نرم افزار Image J و با استفاده از تصویرهای میکروسکوپ الکترونی روبشی از نمونهها تعیین شد. برای این کار، از نقاط مختلف داربستها، سه تصویر با بزرگنمایی 20 برابر تهیه شد. برای هر تصویر مساحت تمامی منافذ موجود مشخص شد و متوسط مساحت منافذ داربستها، با محاسبه میانگین مقادیر به دست آمده تعیین شد.
.4-2 آزمون MTT
این آزمون به منظور بررسی زندهمانی سلولهای مزانشیمی انسانی روی داربست انجام شد به این صورت که ابتدا داربستهای ساخته شده توسط اشعه UV سترون و سپس با ریختن محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد FBS روی آن pH داربستها خنثی شد. سلولهای مزانشیمی روی داربستها با دانسیته 120/000 سلول در هر میلیلیتر کشت داده شد و آزمون MTT در روزهای 1، 3، 5، 7 و 14 با سه بار تکرار انجام شد.
ابتدا 20 میکرولیتر محلول MTT و 200 میکرولیتر محیط RPMI روی هر داربست حاوی سلول در روزهای مورد نظر ریخته شد و بعد از سه ساعت محیط روی داربستها خارج و 200 میکرو لیتر DMSO جهت حل کردن رسوب بنفش رنگ حاصل از واکنش آنزیم میتوکندری فعال با محلول MTT به آنها اضافه شد، سپس 100 میکرولیتر از محلول بنفش رنگ برداشته و جذب آن در طول موج 570nm توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده شد. مقدار جذب در روزهای مختلف برای داربستهای از کیتین/کیتوسان و کیتوسان خالص مقایسه شد.
.3 نتایج و بحث
.1-3 ریخت شناسی داربست
تخلخل، به هم پیوستگی منافذ و همچنین ریخت شناسی داربستهای کبتوسان خالص و کیتین/کیتوسان با میکروسکوپ الکترونی بررسی شد. نتایج مربوط به این آزمون برای دو نوع داربست کیتین/کیتوسان و کیتوسان خالص با بزرگنمایی یکسان در شکل 1 نشان داده شده است.
