بخشی از مقاله
چکیده:
میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی موجود در عصاره متانولی انار، به ترتیب با روشهای رنگسنجی Folin-Ciocalteu و کلریدآلومینیوم محاسبه شد. خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره، بر اساس توانایی عصاره در مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید و توانایی به دام اندازی رادیکال DPPH بررسی گردید . تاثیر عصاره پوست انار بر فعالیت آنزیم تیروزیناز ، براساس روش رنگ سنجی تعیین گردید .
بر اساس نتایج به دست آمده، عصاره متانولی پوست انار سبب به دام اندازی رادیکال آزاد DPPH شد که این پدیده با افزایش غلظت عصاره، به طور معنی داری افزایش یافت. همچنین عصاره انار، قادر به مهاراکسیداسیون لینولئیک اسید بود. غلظتهای مختلف عصاره پوست انار، فعالیت آنزیم تیروزیناز را به طور قابل توجهی کاهش دادند که این روند کاهشی با افزایش غلظت عصاره، به طور معنی داری افزایش یافت . - p<0.05 -
مقدمه:
میگو فرآوردهای بسیار فسادپذیر است. یکی از فاکتورهای محدود کننده مدت ماندگاری میگو، قهوهای شدن آنزیمی - ملانوز - است. ملانوز در اثر فعالیت آنزیم تیروزیناز - پلی فنول اکسیداز - صورت میگیرد. این تغییر رنگ، به طور قابل ملاحظهای بازار پسندی محصول را کاهش میدهد - مونترو و همکاران، . - 2001 سولفیتها یکی از پرکاربردترین ترکیبات در مهار ملانوز هستند، اما این ترکیبات میتوانند منجر به بروز واکنشهای آلرژی و اختلالات تنفسی در افراد مبتلا به آسم گردند - فرر و همکاران، . - 1999 از این رو یافتن ترکیبات طبیعی که بتواند فعالیت آنزیم تیروزیناز را مهار نماید از اهمیت ویژهای برخوردار است.
انار - Punica granatum L. - گیاهی باستانی و منحصر به فرد بوده که در نواحی مختلف از جمله خاورمیانه رشد میکند - سرخوش و همکاران، . - 2006 ایران یکی از مهمترین تولیدکنندگان و صادرکنندگان انار در دنیا است. بخشهای مختلف انار - پوست، دانه، گل و آب انار - حاوی مقادیر قابل توجهی ترکیبات پلی فنولی با خواص آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی است
در بین اجزای مختلف، عصاره پوست انار، دارای بیشترین فعالیت آنتیاکسیدانی در شرایط آزمایشگاهی است که با میزان بالای ترکیبات فنولی موجود در این بخش همبستگی دارد - گوآ و همکاران، . - 2007 از آنجا که مطالعهای در ارتباط با تاثیر عصاره انار بر مهار آنزیم تیروزیناز میگو صورت نگرفته است، بنابراین در این مطالعه به بررسی میزان محتوای فنولی و فلاونوئیدی، خاصیت آنتیاکسیدانی و احیاکنندگی عصاره متانولی پوست انار سویه رباب و تاثیر آن بر آنزیم تیروزیناز میگو پرداخته شد.
مواد و روش ها:
عصاره گیری از پوست انار - سویه رباب - :
انار سویه رباب از باغی در شیراز تهیه شد. پوست انار پس از جداشدن در آون 50 C خشک شده و سپس پودر گردید. پودر حاصله به نسبت 1/20 - W/V - در متانول ریخته شد و به مدت چهار ساعت در دمای 40 C، با سرعت 200 دور در دقیقه به هم زده شد، سپس به مدت یک شبانه روز در دمای اتاق نگهداری شد. عصاره حاصله فیلتر شد و به منظور خروج حلال در تبخیرکننده با دمای40 C قرار گرفت
اندازه گیری میزان ترکیبات فنولی:
میزان ترکیبات فنولی عصاره، به روش رنگ سنجی Folin-ciocalteu - F-C - صورت گرفت. 1ml از عصاره به دست آمده در مرحله قبل با 0/5 ml معرف F-C و 2/5 ml کربنات سدیم 20 درصد مخلوط شد و 40 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد سپس جذب نوری مخلوط حاصله توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 725 نانومتر قرائت گردید. نتایج به صورت میزان معادل تانیک اسید با عصاره - g/100 g - بیان گردید
اندازه گیری میزان ترکیبات فلاونوئیدی عصاره متانولی پوست انار:
میزان ترکیبات فلاونوئیدی توسط روش رنگسنجی آلومینیوم کلراید توسط اسپکتروفتومتر صورت گرفت - کم و هیسیل، . - 2010 یک میلی لیتر عصاره رقیق شده پوست انار با 4 میلی لیتر آب مقطر و 0/3 میلی لیتر نیتریت سدیم 5 درصد مخلوط شد. پس از 5 دقیقه، 0/3 میلی لیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد به آن اضافه شد. 6 دقیقه بعد، 2 میلی لیتر سود یک مولار به آن اضافه شد پس از افزودن 2/4 میلی لیتر آب مقطر، جذب نوری محلول حاصله در طول موج 510 نانومتر در برابر بلانک - آب مقطر - خوانده شد. از پنج غلظت مختلف کاتکین - 20-100mg/L - برای رسم منحنی استانداد استفاده شد. نتایج نهایی بر اساس میزان mg کاتکین معادل با گرم ماده خشک عصاره بیان گردید.
تعیین خاصیت احیاکنندگی عصاره انار:
0/2 میلی لیتر از عصاره انار، با 2/5 میلی لیتر لینولئیک اسید و 2/3 میلی لیتر بافر فسفات پتاسیم هموژن شد و در دمای 37 C در تاریکی گرمخانه گذاری گردید. مقداری از محلول به دست آمده، با اتانول، تیوسیانات آمونیوم وکلرید فروس به مدت سه دقیقه مخلوط شد و عدد پراکسید با محاسبه جذب نوری مخلوط حاصله در طول موج 500 نانومتر محاسبه شد. درصد مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید به صورت زیر محاسبه گردید
- تعیین خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره پوست انار:
توانایی به دام اندازی رادیکال 1 و-1دی فنیل -2پیکریل هیدرازیل - DPPH - طبق روش سینگ و همکاران - 2002 - با کمی تغییر صورت گرفت. یک دهم میلی لیتر از غلظت های مختلف عصاره متانولی پوست انار با 3/9 میلی لیتر محلول DPPH مخلوط شد و به مدت 20 دقیقه در حمام آب با دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری گردید. سپس جذب نوری محلول حاصله در طول موج 515 نانومتربا اسپکتروفتومتر قرائت گردید. هر تیمار سه بار تکرار گردید. محلول کنترل شامل 0/1 میلی لیتر آب غیر یونیزه و 3/9 میلی لیتر محلول DPPH در متانول بود. فعالیت به دام اندازی رادیکال آزاد DPPH توسط معادله زیر محاسبه گردید:
- جداسازی آنزیم تیروزیناز از میگو : - penaeus vannamei -
ناحیه سفالوتوراکس میگوها جداشده، آسیاب و پودر شدند. پودر میگو با بافر فسفات سدیم حاوی کلرید سدیم و Triton X-100 - به نسبت 1 به - 3 مخلوط شد و پس از یک مرحله سانتریفیوژ در دور 8000g و دمای4 C ، به مایع رویی، سولفات آمونیوم جامد تا رسیدن به درجه اشباع، اضافه گردید. پس از 30 دقیقه نگهداری در دمای 4 C ، محلول مجددا در دور 12500g سانتریفیوژ شد و رسوب حاصله در بافر فسفات سدیم با pH 7/2 حل شد و در برابر بافر فسفات سدیم دیالیز گردید. مواد غیر قابل حل با کمک سانتریفیوژ برداشته شده و مایع رویی حاصله به عنوان نمونه خام آنزیم تیروزیناز مورد استفاده قرار گرفت
- تعیین فعالیت آنزیم تیروزیناز جداسازی شده از میگو:
100 میکرولیتر ازعصاره تیروزیناز، 600 میکرولیتر 15 L-DOPA میلی مول در آب غیر یونیزه و 400 میکرولیتر بافر فسفات 0/05 مولار - pH 6 - را در آب حل کرده و به مدت پنج دقیقه در دمای 45 C گرمخانه گذاری شدند. با کمک دستگاه Absorbance reader جذب نوری محلول در طول موج 475 نانومتر به مدت 5 دقیقه مانیتور شد و تشکیل دوپاکروم که با افزایش جذب نوری همراه بود مورد بررسی قرار گرفت و فعالیت آنزیم محاسبه گردید - نیرمال و بنجاکول، . - 2010 یک واحد فعالیت آنزیم به صورت افزایش 0/001 واحد جذب نوری در هر دقیقه در هر میلی لیتر تعریف گردید. با حذف سوبسترا و آنزیم و افزودن آب غیر یونیزه به جای آن ها به محلول، بلانک آنزیم و سوبسترا تهیه گردید.
- ارزیابی اثر متانولی پوست انار بر فعالیت آنزیم تیروزیناز:
100 میکرولیتر از غلظت های مختلف عصاره متانولی پوست انار 0/05 - ، 0/1، 0/2، 0/4 و0/8 درصد - ، با 100 میکرولیتر آنزیم تیروزیناز مخلوط شد تا غلظت های 0/025، 0/05، 0/1، 0/2 و 0/4 درصد به دست آمد. مخلوط حاصله به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق گرمخانهگذاری شد و پس از افزودن 400 میکرولیتر بافر فسفات 0/05 مولار - pH 6 - و 600 میکرولیتر 15 L-DOPA میلی مولار - با دمای - 45 c به آن، جذب نوری محلول حاصله در طول موج 475 نانومتر قرائت گردید. در نمونه کنترل، به جای عصاره متانولی انار، از آب غیر یونیزه استفاده شد - نیرمال و بنجاکول، . - 2010 میزان فعالیت باقیمانده آنزیم پلی فنول اکسیداز به صورت زیر محاسبه گردید:
