بخشی از مقاله
بررسی خواص نوعی داربست زیست تخریب پذیر پلیاستر یورتانی بر پایه
پلیکاپرولاکتون جهت کاربرد در مهندسی بافت
چکیده
کاربرد پلیمرهاي زیست تخریب پذیر به عنوان یکی از پیشرفتهاي عمده در تحقیقات مواد در پزشکی مطـرح اسـت. بـه عنـوان مثـال در مهندسی بافت از ماتریس ها و داربست هاي زیست تخریب پذیر پلیمري به عنوان حامل سلول براي بازسـازي بافـت هـاي معیـوب اسـتفاده میشود. در این تحقیق، داربستهاي متخلخل پلی استر یورتانی زیست تخریب پذیر با سایز تخلخل 50 تا 250 میکرومتر به روش ترکیبی شستشوي نمک و freeze-drying تهیه گردید و خواص فیزیکی و مکانیکی آنها به کمک دستگاه پراش پرتو ایکس (XRD)، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و آزمون تست کشش ارزیابی شدند. بررسی خصوصیات مکانیکی نشان دادند که استحکام کششی، درصد ازدیـاد طول تا نقطه شکست و مدول یانگ نمونهها به ترتیب در محدوده 4/8 تا 6/6 مگا پاسکال، 60 تا 120 درصد، 24 تا 56 مگا پاسکال بـود و مدول یانگ و استحکام کششی با افزایش نسبت NCO/OH افزایش مییابند. همچنین آزمون تخریبپذیري نمونهها بصورت دینامیکی در دماي 37-0/1œC در محلول بافر فسفات با pH=7/4-0/2 انجام گرفت. زیست سازگاري نمونهها نیز با استفاده از آزمون کشت سلولی رده سلولی L-929 مطالعه شد که حاکی از زیستسازگاري مناسب نمونهها بود.
واژههاي کلیدي: پلیاستر یورتان، داربست مهندسی بافت، زیست تخریب پذیري، خواص مکانیکی.
-1 مقدمه
پلییورتانهـا خـانوادهاي از پلیمرهـا هسـتند کـه بـه دلیـل خــواص زیســتســازگاري و مکــانیکی مناســب کاربردهــاي بسیاري به عنوان بیومتریال یافتهاند .[4-1] از پلییورتانهـا در ســاخت کتترهــا [5]، پوشــش ضــربانســازهاي قلبــی، دریچههاي قلبی مصـنوعی [6]، بطـن کمکـی قلـب 7]و[8، مهندسی بافـت 9]و[10 و سیسـتمهـاي نـوین دارو رسـانی [11] بهره برده شده است. مهندسی بافت یکی از جدیدترین روشهاي تحقیقاتی مورد استفاده در ترمیم بافتهاي آسیب دیده بـدن بـوده کـه در آن بـا اسـتفاده از داربسـت زیسـت تخریــب پــذیر متخلخــل، تــرمیم بافـت صــورت مــیگیـرد 12]و.[13 این داربسـتهـا بـه عنـوان حامـل سـلول بـراي بازسازي بافتهاي معیوب بکار برده میشوند و خـواص آنهـا در موفقیت بیومتریال نقش تعیین کنندهاي دارد .[13]
انتخــاب مــواد اولیــه و روش تهیــه داربســت پلــییورتــانی، پـذیرخصوصیات زیسـتتخریـب آن ي و زیسـتسـازگاري را تحت تأثیر قرار میدهد 1]و.[15 ديایزوسیاناتهایی ماننـد هگــزامتیلن ديایزوســیانات و پلــیالهــاي اســتري نظیــر پلیکاپرولاکتون ديال از جمله مواد اولیه مـورد اسـتفاده در سنتز پلییورتانها بهشمار میروند .[16] در حقیقت وجـود پیوند استري در سـاختار نهـایی پلـییورتـان، عامـل اصـلی تخریـب پـذیري آن محسـوب مـیشـود .[15] هگـزامتیلن ديایزوسیانات به دلیل طبیعت غیرسمی آن پر مصرفتـرین ایزوســیانات بکــار رفتــه در ســاختار پلــییورتــانهــاي زیستتخریب پذیر بوده است .[17] ساختار مولکولی متقارن این ماده موجب برهمکنشهاي بین مولکولی قوي با تشکیل پیوندهاي هیدروژنی میشود. در نتیجه میتـوان مـوادي بـا استحکام بالا تهیه نمـود .[18] پلـیکـاپرولاکتون، پلیمـري
زیستتخریب پذیر با محصولات تخریب زیستسازگار اسـت و براي تهیه پلیاستر یورتانها در تحقیقات زیـادي اسـتفاده شده است .[23-19]
روشهاي زیادي براي تهیـه داربسـتهـاي متخلخـل مـورد بررسی قـرار گرفتـه اسـت کـه از جملـه آنهـا مـیتـوان بـه روشهاي شسشتويریختـهعامل حفرهزا، گـري بـا حـلال و freeze-drying و . . . اشاره نمود. در تحقیقات جدیـد بـراي دستیابی به ابعاد تخلخل مناسـب و درصـد تخلخـل بـالا، از روشهاي ترکیبی نیز بهره گرفته میشود 24]و.[25
در این تحقیق، پلییورتانهاي زیسـت تخریـب پـذیر برپایـه پلــیکــاپرولاکتون (PCL)، هگــزامتیلن دي ایزوســیانات (HMDI) و کـــــــوپلیمري از 1و-4 بوتـــــــان دي ال BD/HMDI/(BD) به روش ترکیبی شستشـوي نمـک و freeze-drying تهیه شـد و خـواص فیزیکـی و مکـانیکی آنها بررسی گردید.
دماي 80œC به مدت 30 دقیقه با همزن مکانیکی و تحـت اتمسفر نیتروژن انجام شد. در انتها مقدار اضـافی بوتـان دي ال بوسیله استون خشک شستشو و خارج شد.
پلیکاپرولاکتون درون راکتـور در دمـاي 80œC ذوب شـد و هگزامتیلن دي ایزوسیانات با نسبت هاي مولی NCO/OH به ترتیب 2/1، 4/1 و 6/1 بهصورت قطره قطره به آن اضـافه گردید. این واکنش به مدت 4 ساعت تحت اتمسفر نیتـروژن ادامه یافت تا پیشپلیمر بدست آید (جدول .(1
در نهایت زنجیر افزاینده که یک جامد سفید رنگ بـود در دي متیل سولفوکساید (DMSO) بـا نسـبت وزنـی w/w 50% حل شد و به پیشپلیمر اضافه گردید. این واکنش نیز به مدت 30 دقیقه ادامه پیدا کرد. در انتها نمونـه از راکتـور خارج گردید و با آب شستشو داده شد. پس از آن در دمـاي 40œC در آون خلاء با فشار 20mbar قرار گرفت تـا بطـور کامل خشک شود.
-2 مواد و روشها
-1-2 مواد اولیه
پلـیکــاپرولاکتون ديال (PCL) از شـرکت Aldrich بــا وزن مولکولی 2000gr/mol و 1و-4بوتان ديال (BD) بـا وزن مولکــولی 90/18 gr/mol محصــول شــرکت Merck بودند که قبل از استفاده در آون خلاء تحت فشـار 5 mbar و در دما 100œ C به مدت 24 ساعت آبگیري شـدند. هگـزا متیلن دي ایزوسـیانات (HMDI) و حـلالهـاي ديمتیـل سولفوکســـاید (DMSO) و 1و -4دي اکســـان محصـــول شرکت Merck بودند و به همان صورت اولیه مورد استفاده قـرار گرفتنـد. بــراي ایجـاد تخلخـل از ذرات نمــک NaCl شرکت Merck استفاده شد و به کمک الـکهـاي مناسـب اندازه ذرات بین 150 تا 300 میکرومتر جدا گردید.
-2-2 روش سنتز
براي سنتز پلییورتانها از یک راکتور چهاردهنـه شیشـهاي همراه با همزن مکانیکی (400rpm) استفاده شد. ابتدا زنجیر افزاینده از واکـنش 1و-4 بوتـان دي ال و هگـزا متـیلن دي ایزوسیانات با نسبت مولی 6 به 1 تهیه گردیـد. واکـنش در
جدول :1 نسبتهاي NCO/OH در نمونهها
-3-2 ایجادتخلخل در نمونهها
براساس تحقیقات انجام گرفته در مـورد روشهـاي سـاخت داربســتهــاي پلــییورتــانی، یکــی از مناســبتــرین و اقتصاديترین روشها، استفاده از نمک براي ایجـاد تخلخـل است .(Particulate Leaching) سادگی و سهولت ایـن روش و عدم نیاز به تجهیزات پیچیده در فرآیند ساخت و همچنین استفاده از عوامل غیر سمی (NaCl) براي ایجـاد تخلخـل در داربست به جاي ورود ترکیبات سمی در محصـول نهـایی، از جمله مزایاي آن بهشمار میرود. ضمن اینکه، نمک باقیمانده با آب مقطر شسته میشود.
جهت ایجاد تخلخل در ساختار، ابتدا نمونههاي سـنتز شـده در 1 و 4 دياکسان با غلظت 20%w/w حل شد. سپس بـه ازاي هرگرم پلیمـر، 2/5 گـرم ذرات NaCl بـا انـدازه مـش
300- 150 میکرومتر به محلول اضافه شـد. پـس از آن بـه میزان %4 وزن کل مخلوط، آب مقطر اضافه گردید. در ادامه به سرعت محلول تا دماي -15 °C سرد شد و سپس تحـت عملیات freeze-drying (دستگاه Christ Alpha 1-2 LD محصول کشور آلمان) قرار گرفت.
براي خارج شدن و حل شدن ذرات نمک، نمونهها بـه مـدت 12 ساعت در آب مقطر قرار گرفتند تا با حـذف ذرات نمـک ساختار متخلخل نهایی حاصل شود.
-4-2 روشهاي شناسایی و ارزیابی
طیف FT-IR بهوسـیله دسـتگاه BOMEM مـدل MB100-SERIES ساخت کشور کانادا گرفته شـد. از دسـتگاه پـرس GRASEBY SPECAC ساخت کشور کانادا جهـت فشـرده آمادهسازي نمونهها و سازي آنها براي آزمون کشش استفاده گردیــد. دســتگاه SEM مــدل LEO 440I ســاخت کشــور انگلیس براي بررسی مورفولوژي تخلخلها مورد استفاده قرار گرفـت. پوشـشدهـی تحـت جریـان 18mA و فشـار خـلاء 2mbar انجام گرفت. دستگاه تست خواص مکانیکی در ایـن آزمـایش INSTRON 1195 سـاخت کشـور انگلسـتان بـود، سرعت کشش نمونهها برابر 1mm/min و طول نمونه بین دو فک برابر 18mm تنظـیم شـد. همچنـین از دسـتگاه XRD مدل 3003 PTS، با سیستم اسکن مرحلـهاي بـراي گـرفتن
طیف XRD بهره برده شد.
جهت ارزیابی سمیت سلولی و زیستسازگاري، ابتدا تمـامی موارداملاًک شستشو داده شدند و سـپس توسـط اتـوکلاو در دماي 121°C براي مدت 20 دقیقه اسـتریل شـدند. پـس از آن به ترتیب مراحل زیر جهت آزمایش کشت سـلولی انجـام شد. سلولهاي مورد استفاده سـلول فیبروبلاسـت دم مـوش L929 بودند. پس از قرارگیري نمونهها درون پلیت کشت، به هر خانه مقدار 2ml محیط کشت سرم و سلول اضافه شـد و سپس پلیت کشـت درون انکوبـاتور CO2 و در دمـاي 37°C قرار گرفت. پس از گذشت یک هفته از زمان کشت، نمونهها مورد ارزیابی و بررسی قرار گرفتند.
-3 بحث و نتیجه گیري
-1-3 بررسی نتایج خواص مکانیکی
در جدول 2 نتایج حاصل از تست کشش نمونهها آورده شده است. نمونه PUA1 نسبت به نمونههاي دیگر داراي درصـد ازدیاد طول بیشتري بوده و نمونه PUA3 بیشـترین مقـدار استحکام کششی و مدول یانگ را دارا است. این نتایچ نشـان میدهد که با افـزایش درصـد NCO در ترکیـب پلـیاسـتر یورتان، استحکام کششی افزایش یافته و درصد تغییـر طـول تا نقطه شکست کاهش مییابد.
-2-3 بررسی طیف XRD نمونهها
طیف XRD بیانگر میزان بلـورینگی نمونـههـاي نمونـههـاي پلییورتان سنتز شده است. طیفهـاي بدسـت آمـده نشـان میدهند که نمونـههـا داراي بخـشهـاي بلـورین و آمـورف هستند. همچنین مشاهده مـیشـود کـه ذرات نمـککـاملاً شسته نشده و در داربست باقی مانده است.
با مقایسه طیف XRD نمونـههـا مشـاهده مـیشـود کـه بـا افـزایش ديایزوسـیانات در ترکیـب پلـییورتـانهـا، درصـد بلورینگی افزایش مییابد. ایـن امـر ناشـی از وجـود سـاختار متقارن هگزامتیلن ديایزوسیانات است که افزایش آن باعث افزایش بلورینگی پلیمر میگردد.
شکل :1 طیف XRD نمونهها
-3-3 بررسی نرخ تخریبپذیري in vitro
تخریب پذیري نمونههاي پلییورتانی در دماي 37-0/1œC به مدت 18 هفته بررسی شد. براي این کـار از محلـول بـافر فسفات با pH=7/4-0/2 استفاده گردید که بـه ازاي هرگـرم پلـی از نمونههـاي یورتـانی 3/5 ml از محلـول بـافر فسـفات اختصاص داده شد. این آزمایش بـهصـورت دینامیـک انجـام
گرفت و طی آن در هر 2 هفته محلول بافر فسـفات تعـویض شد. پس از بازههاي زمانی 2 هفته، نمونههـا از محلـول بـافر فسفات خارج شدند و بـه مـدت 1 سـاعت در آون خـلاء بـا دماي 50°C و فشار 15mbar قـرار گرفتنـد. سـپس تـوزین شدند و کاهش وزن نمونهها ثبت گردید. پیچیدگی ساختار، مورفولوژي و درصد بلورینگی پلیمـر در تخریـب پـذیري آن نقش مهمی دارد .[18] این آزمایش نشان داد که با افـزایش نسـبت NCO/OH در پلیمـر، پیونـدهاي عرضـی و سـاختار شبکهاي بیشتر شده و نفوذ آب و مایعات بـه درون سـاختار پلیمر کاهش مییابد. نمودار 1 روند تخریب نمونهها را طـی 18 هفته نشان میدهد.
نمودار :1 نمودار کاهش وزن نمونه ها برحسب مدت زمان
قرارگیري (هفته) در محلول بافر فسفات
-4-3 بررسی ساختار تخلخلباها SEM
در مهندسی بافت تخلخلهاي داربست یکـی از پارامترهـاي مهم و اساسی محسوب میشـود. انـدازه و نظـم تخلخـلهـا، اتصال و بهم پیوستگی تخلخـلهـا، چسـبندگی سـلولهـا و توانائی نفوذ سلولهـا بـه داخـل داربسـت در موفقیـت یـک داربست مهندسی بافت اهمیت زیادي دارنـد. تخلخـلهـا از یک طرف موجب کاهش استحکام مکانیکی داربست شـده و از طرف دیگر براي آنکه سلولها بتوانند درون این تخلخلها نفوذ و رشد کنند، داربسـت بایـد داراي سـایز تخلخـلهـاي مناسبی باشد. به عنوان مثـال در مهندسـی بافـت غضـروف تخلخلهاي با ابعاد 50 تا 150 میکرومتر براي رشد سلولها مناسب هستند. سلولها در تخلخلهاي بسیار ریز نمیتوانند
