بخشی از مقاله
چکیده :
به منظور استفاده بهینه از فراورده های جانبی ماهی ، کلاژن اسیدی - 1ASC - از پوست و استخوان ماهی قزل آلای رنگین کمان - - Onchorhynchus mykiss - جداسازی شد.بازده استخراج کلاژن در مورد پوست و استخوان به ترتیب %9/448 و %1/122 بر اساس وزن مرطوب بود.بر اساس الگوی الکتروفورز، هر دو نوع کلاژن به عنوان کلاژن نوع І با میزان ایمینو اسید نسبتا پایین و ترکیب آمینو اسیدی تقریبا متفاوت طبقه بندی شدند.کلاژن پوست و استخوان به ترتیب در 9 pH و 7 کمترین حلالیت را داشتند. غلظت نمک تا %3 تغییری در حلالیت کلاژن ها ایجاد نکرد ولی در مقادیر بالای %3 نمک ، کاهش شدیدی در حلالیت وجود داشت.با استخراج و بررسی ویژگی های کلاژن قزل آلای رنگین کمان ، می توان آن را به صورت کاربردی تر در کشت های سلولی،ترمیم پوست وتجهیزات پزشکی و بویژه غذاهای عملگر مورد استفاده قرار داد.
کلمات کلیدی : کلاژن اسیدی، قزل آلای رنگین کمان، پوست ، استخوان
مقدمه:
در طی فراوری ماهی ، مقادیر زیادی از ضایعات شامل آب و مواد جامد تولید می شوند - . - 7ضایعات جامد ،% 50-70مواد خام اصلی را در بر می گیرد و بسته به فرایند مورد استفاده ، این ضایعات مخلوطی از بخش های مختلف ، سر ها ، امعاءو احشا و استخوان می باشد - . - 7 مصرف نا مناسب این ضایعات می تواند منجر به آلودگی شده و بوی بدی را ایجاد کند،ازاینرو مصرف بهینه ضایعات فراوری ماهی ، به ویژه تولید فراورده هایی با ارزش افزوده ، از اهمیت قابل توجهی در این خصوص برخوردار می گردد. کلاژن و ژلاتین، به دلیل خواص بی نظیر شیمیایی خود کاربرد های گسترده ای در صنایع مختلف و مواد غذایی دارند - . - 2 به طور کلی ، پوست و استخوان گاو و خوک ، به عنوان منابع اصلی استخراج کلاژن و ژلاتین هستند. .وقوع بیماری جنون گاوی ، منجر به ایجاد تشویش در بین مصرف کنندگان ژلاتین گاوی شده است .
به علاوه ، کلاژن و ژلاتین حاصل از پوست و استخوان خوک ، به دلایل محدودیت های مذهبی نمی توانند مورد استفاده قرارگیرند - - 12، در نتیجه استخوان و پوست ماهی حاصل از ضایعات فراوری آبزیان را می توان به عنوان جایگزین منابع ژلاتینی و کلاژنی مذکور در نظر گرفت. درحدود 30% ضایعات فراوری آبزیان را استخوان و پوست تشکیل می دهند که که غنی از کلاژن هستند - . - 13 در میان گونه های ماهیان مورد استفاده ، قزل آلا یکی از متداولترین گونه ها برای تولید فیله های ماهی میباشد، که در نتیجه فراوری مقادیر زیادی استخوان و پوست ایجاد می گردد.بنابراین استخراج کلاژن راه ارزشمندی جهت استفاده کامل از این ضایعات و تولید فراوردهای با ارزش افزوده است .
مواد و روش ها :
-1 آماده سازی نمونه هاو استخراج کلاژن :
پوست و استخوان قزل آلای رنگین کمان - - O. mykiss از شرکت کیان ماهی خزر واقع در شهرستان بابلسر تهیه شد.پس از شستشو و قطعه بندی ، پوست ها و استخوان ها بسته بندی شده و دردمای - 25°c نگهداری شد. استخراج کلاژن، به روش ناگایی و سوزوکی - 8 - ودر دمای 4 ° c صورت گرفت.به منظور حذف پروتئین های غیر کلاژنی ، پوست و استخوان باسود 0/1 نرمال به نسبت - 1:10 - W/Vمخلوط و به مدت 6 ساعت هم زده شد و جهت چربی گیری از بوتیل الکل %10 به مدت 18 ساعت استفاده شد.بعد از شستشو ، نمونه ها در محلول اسید استیک 0/5مولار به نسبت30 w/v و به مدت 24ساعت قرار داده شد. مخلوط صاف شده و کلاژن با افزودن نمک تا غلظت نهایی 2/6 مولار ترسیب و به مدت یک ساعت در 20000g سانتریفیوژ - - sigma,3k30 شد و کلاژن رسوب یافته، به روش انجمادی - FDU-7012 و - Operon خشک شد..در مورد استخوان ، بعد از تیمار با سود و حذف کلسیم از استخوان با 0/5 EDTA مولار به نسبت - w/v - 1:10 به مدت40 ساعت، سایر مراحل مشابه استخراج کلاژن از پوست انجام شد.
-2 تعیین خصوصیات فیزیکو شیمیایی ژلاتین :
ترکیبات پوست و استخوان و کلاژن تولیدی، با استفاده از روش های استاندارد - 4 - تعیین شد. به منظور تعیین وزن مولکولی کلاژن، SDS-PAGE به روش لاملی - 6 - انجام شد.نمونه های کلاژن به نسبت - v/v - 1:1 با بافر نمونه مخلوط شدند و در حجم 15 ماکرولیتر در ولتاژ ثابت 50mv ، الکتروفورز - - clevear شدند.بعد از رنگبری ، دانسیتومتری با استفاده از ژل اسکن - SynGene - انجام شد. ترکیب آمینو اسیدی نمونه های لیوفیلیزه شده کلاژن پوست و استخوان ، توسط دستگاه آمینواسید آنالایزر سازمان انرژی اتمی تهران تعیین شد. میزان هیدروکسی پرولین به روش ویسنر - - 16 اندازه گیری شد.
ویسکوزیته 20میلی لیتر از کلاژن %0/03 در اسید استیک 0,1 مولار با استفاده از ویسکومتر بروکفیلد - - LVDVІІ+Pro،با شماره اسپیندل S00 و سرعت 90 rpm اندازه گیری شد .محلول کلاژن از4 ˚ C تا 50˚ C، با شدت حرارت دهی 0/4 ˚C/min، حرارت دید. جهت اندازه گیری حلالیت ، کلاژن در اسید استیک 0/5 مولار تا رسیدن به غلظت نهایی 3mg/ml و در دمای4 ˚ C کاملا حل شد.به منظور تعیین تاثیر PH در حلالیت کلاژن ، از بافر هادر 1pH تا 12 استفاده شدودر بررسی تاثیرنمک در حلالیت، محلول کلاژن با غلظت های مختلف نمک - %0 ، %2 ، %4 ، %6 ، %8 ، % 10 و - w/v %12مخلوط و در 20000g و دمای 4 ˚ C، به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شدو میزان پروتئین سوپرناتانت به روش بیورت اندازه گیری شد.
بحث و نتایج :
ترکیبات پوست ، استخوان و کلاژن ماهی قزل آلای رنگین کمان ، در جدول 1نشان داده شده است. پوست میزان بالاتری از هیدروکسی پرولین و کلاژن را نسبت به استخوان در بر می گیرد. هنگام استخراج کلاژن از پوست و استخوان ،بالاترین بازده بر اساس وزن مرطوب - %9/448 - در مورد پوست ،در مقایسه با - %1/122 - برای استخوان مشاهده شد. بازده استخراج کلاژن با میزان کلاژن و هیدروکسی پرولین در پوست و استخوان تطابق دارد.بر اساس جدول2 ، ترکیب آمینو اسیدی کلاژن پوست ، اندکی متفاوت از کلاژن استخوان می باشد.کلاژن پوست در مقایسه با استخوان ، میزان بالاتری ازهیدروکسی پرولین و پرولین را دارا می باشد. میزان ایمینو اسید کلاژن پوست و استخوان به ترتیب185 و156در 1000باقیمانده بود ،که این رقم کمتر از کلاژن پوست خوک با 220 در 1000 باقیمانده آمینو اسیدی است - . - 5
میزان ایمینو اسید کلازن حیوانات باشرایط زیستی آنها همبستگی مستقیم دارد .کلاژن ماهی میزان ایمینو اسید کمتری در مقایسه با کلاژن پستانداران دارد . - 3 - بر اساس نتایج ، درجه هیدروکسیله شدن پرولین دراستخوان - - %42, 3 شدیدتر ازپوست - - %39,45 بود.پرولین هیدروکسیله نقش مهمی در تثبیت مارپیچ سه بعدی ایفا می کند . - 11 - تفاوتی در الگوی الکتروفورز کلاژن پوست و
استخوان - شکل - 1 ، وجود نداردو هر دو نوع کلاژن پوست و استخوان ،از حداقل دو نوع زنجیره α،α1 و α2 تشکیل شده اند. نتایج با پوست و استخوان سایر گونه هامطابقت داشت - . - 8 بر اساس جریان الکتروفورزی و ترکیب زیر واحدها به نظر می رسد که کلاژن پوست و استخوان ماهی قزل آلای رنگین کمان ، از نوع І باشد.که ، کلازن اصلی پوست و استخوان محسوب می شود - . - 9هچنین بر اساس نتایج هر دو نوع کلاژن غنی از اتصالات بین و درون مولکولی و ترکیبات β وγ بودند.
ویسکوزیته نسبی محلول کلاژنی، با افزایش دما تا به طور پیوسته کاهش یافت و در دامنه حرارتی30 ˚ C تا50 ˚ C شدت کاهش با تاخیر روبرو بود.تیمار حرارتی در دمای بالا باعث شکسته شدن پیوند های هیدروژنی و در نتیجه تثبیت ساختار کلاژنی می شود - . - 17 بر اساس نتایج ، تغییرات مشابهی در ویسکوزیته کلاژن پوست و استخوان در تیمار های مختلف حرارتی مشاهده شد.دناتوراسیون ساختار کلاژن با تیمار حرارتی با تغییرات در ویسکوزیته آنها ارتباط دارد - 9،. - 8 تاثیر pH وغلظت NaCl ،بر حلالیت کلاژن ، در شکل2 نشان داده شده است.کمترین حلالیت کلاژن پوست و استخوان به ترتیب در9 pH و 7 مشاهده شده است.به طور کلی هر دو نوع کلاژن در شرایط اسیدی ،محلول تر بوده ،اما به هر حال در شرایطبسیار اسیدی،کاهش اندکی در حلالیت مشاهده شد.زمانیکه pH ،بالاتر و پایین تر از نقطه ایزو الکتریک باشد ، پروتئین به ترتیب دارای بار منفی و مثبت خالص می باشد - - 15در نتیجه آب بیشتری جذب پروتئین ها می شود.
