بخشی از مقاله
چکیده:
ویروس عامل بیماري تب برفکی یکی از زیانآورترین بیماریهاي دامی از جنبه اقتصادي می باشد. در این مطالعه ویروس FMD type A87/IRN در رده سلولی پایدار BHK21 تکثیر داده شد. این ویروس از طریق روش TCID50 تعیین عیار گردید که عیار آن107.5 / ml بدست آمد. نمونه هاي ویروسی توسط پرتو گاما حاصل از چشمه کبالت 60 در دماي -20 °C غیر فعال گردید. آزمون سلامت ویروسهاي غیر فعال شده بر روي سلولهاي IBRS2 انجام گردید، و آنتی ژنسیتی نمونههاي ویروسی پرتودهی شده و نشده به روش ثبوت کمپلمان اندازه گیري شد.
دز اپتی مم براي غیر فعال سازي ویروس FMD بدون تغییر نامطلوب در آنتیژنسیتی آن 40-44 kGy بدست آمد. نمونه هاي ویروسی غیر فعال شده توسط اتیلن ایمین و پرتو گاما با افزودن ادجوانت هیدراکسید آلومینیوم و سایر مواد بعنوان واکسن نرمال و رادیوواکسن فرموله گردید. این واکسنها به گروههاي خوکچه هندي تزریق شده و عیار آنتی بادي در سرم این حیوانات به روش خنثی سازي سرم در طی 8 ماه اندازهگیري شد. ارزش PD50 واکسن نرمال و رادیوواکسن پس از انجام آزمون کارآئی واکسن بترتیب 7.06 و 5.6 تعیین گردید.
مقدمه:
بیماري تب برفکی یکی از واگیردارترین بیماریهاي حیوانات زوج سم میباشد. ویروس عامل این بیماري متعلق به جنس آفتوویروس از خانواده پیکورناویریده میباشد . - 1 - مهمترین راه کنترلی براي ریشهکنی این بیماري واکسیناسیون میباشد. در این مطالعه فن آوري پرتودهی در تهیه واکسن بکار میرود. غیرفعال سازي ویروسها با پرتوهاي یون ساز توسط Pollard, Dertiger و غیره مطالعه شده است 2 - و. - 3 ویروسهاي غیرفعال شده به روش پرتودهی خاصیت آنتینسیتی خود را حفظ مینمایند. ویروس 1FMD غیر فعال شده با پرتو گاما بعنوان یک آنتی ژن خوب در تهیه واکسن ضد آن بکار میرود. نخستین تولید تجاري این رادیوواکسن با یک میلیون دز که بطور موثري گوسالههاي واکسینه شده را علیه بیماري ایمن نمود انجام گردید . - 4 -
مواد و روش کار:
-1 تکثیر و تیتراسیون ویروس: ویروس FMD type A87/IRN بر روي رده سلولی پایدار 2BHK21 بصورت کشت سوسپانسیونی تکثیر داده شد. پس از مشاهده علائم سایتوپاتیک - CPE - روي سلولهاي فوق سوسپانسیونهاي ویروسی در 1000×g بمدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد و مایع روئی آن بعنوان استوك ویروسی در دماي -70 °C ذخیره گردید. تیتر ویروسی به روش 3 TCID50/ml بدست آمد.
-2 غیر فعال سازي ویروس FMD توسط پرتو گاما و اتیلن ایمین: دستگاه گاما سل مدل Issledovapel-PX-30 با رنج دز0.551 گري بر ثانیه و اکتیویتی3652 کوري استفاده شد. نمونه هاي ویروسی در دزهاي متفاوت پرتو گاما: 10، 20، 25، 35، 40، 45 و 50 کیلوگري و در دماي -20 °C پرتودهی شدند . - 4 - پس از پرتودهی در هر یک از دزهاي فوق تیتر ویروسی مجددا“ تعیین گردید. همچنین جهت غیرفعال سازي با اتیلن ایمین ویروس مذکور را بمدت 24 ساعت در دماي 30 °C در معرض 0.035 M/L اتیلن ایمین قراردادیم، براي توقف این واکنش از محلول تیوسولفات سدیم 0.04 M استفاده گردید.
-3 آزمون سلامت و ثبوت کمپلمان: عفونت زائی نمونههاي ویروسی پرتودهی شده در دزهاي متفاوت پرتو گاما از طریق کشت سلولی مورد بررسی قرار گرفت. همه نمونههاي ویروسی پرتودهی شده به کشتهاي سلولی تک لایه IBRS2 تلقیح شدند و تیتر ویروسی آنها نیز به روش TCID50 بدست آمد. خاصیت آنتی ژنسیتی ویروسهاي پرتودهی شده نیز به روش ثبوت کمپلمان بررسی شدند 6 - و. - 7
-4 فرمولاسیون واکسن: نمونههاي ویروسی غیر فعال شده با کلروفورم به میزان 0.006 تیمار گردیدند، بر روي ژل هیدروکسید آلومینیوم جذب شده و توسط ساپونین، گلیسین، فنل رد و فسفات بافر فرموله گردیدند. بنابراین دو نوع واکسن علیه ویروس FMD type A87/IRN تهیه شد یکی غیر فعال شده با اتیلن ایمین بعنوان واکسن نرمال و دیگري غیرفعال شده با پرتو گاما بعنوان رادیوواکسن.
-5 پاسخ ایمنی واکسنهاي غیرفعال شده توسط پرتو گاما و اتیلن ایمین بر روي خوکچههندي: 30 خوکچههندي با وزن بدنی 500-450 گرم انتخاب شده که به 3 گروه 10 تائی تقسیم گردیدند، و با رادیوواکسن و واکسن نرمال بطریق زیرپوستی در ناحیه زیر بغل تلقیح شدند و گروه آخر نیز بعنوان شاهد بدون تلقیح واکسن انتخاب گردید. سرمهاي این حیوانات در طی 8 ماه متوالی با روش خنثی سازي سرم تعیین تیتر گردیدند 8 - ،9و. - 10
-6 آزمون چلنج جهت مطالعه پاسخ حفاظتی: ویروس FMD سازگار شده با کف پاي خوکچه هندي در پاساژ پنجم جمعĤوري شد و پس از صاف کردن در کف پاي دو خوکچه هندي دیگر بصورت درون جلدي تلقیح گردید و پوستههاي کف پاي این حیوانات نیز یعنوان منبع ویروسی براي آزمون چلنج جمع آوري شدند، آزمون چلنج مطابق روش Lucam انجام شد 7 - و. - 10 به این ترتیب که هر دو نوع واکسن هم واکسن نرمال و هم رادیوواکسن در کربنات-بی کربنات بافر در رقتهاي 1:16 تا 1:2، 1:1 رقیق سازي شدند. هر رقت واکسن ها به هر گروه حیوانات بصورت زیرپوستی در ناحیه زیربغل به میزان 0.5 mlبه هر حیوان تلقیح گردید.
دز یادآور به همان میزان بمدت 21 روز بعد تلقیح گردید. بعد از 2 هفته حیوانات واکسینه شده در هر 10 گروه با دو نوع واکسن و 2 گروه شاهد - هر گروه حاوي 5 حیوان - ، نیز با ویروس فعال سازگار شده با خوکچههندي - پاساژ ششم - با تیتر 100 LD50 تیمار گردیدند. کلیه حیوانات در طی 5- 4 روز از نظر بروز زخمهاي اولیه و ثانویه مورد بررسی قرار گرفتند. اگر ویروس فعال در بدن خوکچههندي انتشار یابد وزیکولهاي روي سایر دست و پاهاي و زبان حیوان مشاهده می گردند که علائم عفونت ویروس تب برفکی در خوکچههندي میباشد. دز حفاظتی - PD50 - %50 در هر دو گروه حیوانات واکسینه شده با واکسن نرمال و رادیوواکسن به روش کربر محاسبه گردیدند . - 11 -
نتایج:
جدول 1 تیتراسیون ویروسی را براي نمونههاي پرتودهی شده و پرتودهی نشده بعد از آزمون سلامت نشان می دهد، با افزایش دز پرتودهی تیتراسیون ویروسی کاهش مییابد. همچنین فاکتور4 D10 Value = 5.3- 5.88 کیلوگري بدست آمد. دز مطلوب پرتو گاما براي غیرفعال سازي ویروس FMD با تیتر اولیه 107.5 /ml ، 40 - 44 کیلوگري بدون تغییر نامطلوب در خاصیت آنتی ژنیکی ویروس بدست آمد. نتایج آزمون سلامت براي نمونه هاي پرتودهی شده با دزهاي پرتودهی : 40، 45 و 50 کیلوگري بدون مشاهده هیچ گونه علائم سایتوپاتیک در طی سه پاساژ کور روي کشت سلولی کاملاً مناسب بود.
نتایج آزمون ثبوت کمپلمان براي نمونههاي ویروسی پرتودهی شده و نشده نشان داد که خاصیت آنتی ژنیکی ویروس پرتودهی شده در دزهاي 0-45 کیلوگري بدون تغییر بوده است . - 7 - تیتر آنتی سرم ضد ویروس FMD در خون خوکچه هندي که به روش زیر پوستی در ناحیه زیر بغل و با هر دو نوع واکسن واکسینه شده بودند، بالاتر از تیتر حفاظتی - PD=1.2 - مشاهده گردید. انتشار ویروس فعال در بدن حیوانات گروه شاهد و واکسینه شده توسط Leucam و همکارانش توضیح داده شده است.
بحث: روشهاي غیرفعال سازي ویروس FMD با استفاده از فرمالدئید یا با استفاده از آزیریدینها می باشد، که هر دو در واکسن نهائی باقیمانده بجاي میگذارد که بعضی سمی و بعضی آلرژیک می باشند. همچنین فرآیند غیرفعال سازي با مواد شیمیائی در دماي اتاق بمدت 24-48 ساعت بطول میانجامد که میتواند باعث کاهش تیتر ویروسی گردد، ولی پرتودهی در حالت انجماد مانع از این کاهش تیتر میشود - . - 1 بعضی محققین در آرژانتین براي تولید بعضی واکسنهاي غیرفعال توسط پرتوهاي یونساز برروي غیر فعال سازي بعضی ویروسها مثل FMD و هرپس سیمپلکس ویروس بررسی نمودهاند.
- 4 - محققین طی بررسیهاي نشان دادند که خاصیت آنتی ژنیکی ویروس FMD type C لیوفیلیزه، پس از پرتودهی شده نسبت به ویروسهاي پرتودهی نشده در آزمون ثبوت کمپلمان بدون تغییر می باشد. - 6 - در این مطالعه رنج دز اپتی مم پرتو گاما براي غیرفعال سازي ویروس مذکور در-20 °C بدون تغییر در خاصیت آنتی ژنیک ویروس 40-44 کیلوگري بدست آمد. بنابراین ویروس FMD غیر فعال شده با پرتو گاما بدون تغییر در خاصیت آنتیژنیکی آن و با نتایج آزمون سلامت خوب میتواند بعنوان رادیوواکسن غیرفعال استفاده شود. حیوانات واکسینه شده با رادیوواکسن بهمان خوبی حیوانات واکسینه شده با واکسن نرمال علیه این بیماري ایمن گردیدند.
