بخشی از مقاله
چکیده
یکی از راههاي تقویت اثر واکسنهاي خوراکی استفاده از ادجوانت ها میباشد. RTB داراي نقش ادجوانتی و حاملی بوده و میتوان با ممزوج کردن آنتی ژنهاي کاندیداي واکسن با این ادجوانت به تولید واکسن خوراکی مناسب پرداخت. IpaD نقش مهمی در بیماريزایی و ایجاد عفونت توسط شیگلا دارد. هدف از این مطالعه، ساب کلونینگ کاست ژنی RTB - IpaD به عنوان کاندید واکسن علیه بیماري شیگلوزیز و بررسی بیان آن در درسویهRosetta اشرشیاکلی میباشد. کاست ژنیRTB - IpaD داراي لینکر غیر فورینی با آنزیم برشی SalΙو HindΙΙΙمورد هضم آنزیمی قرار گرفت و در وکتور بیانی pET-28a - + - زیرهمسانه سازي شد و عمل ترانسفورماسیون به درون سلولRosetta انجام گرفت و در ادامه تحت القاي IPTG بررسی بیان پروتئین صورت گرفت.
صحت کار با انجام PCR وهمچنین برش آنزیمی بر روي پلاسمید هاي نوترکیب pET-28a - + - و با انجام الکتروفورز مورد تایید قرار گرفت. آنالیز تعیین توالی نشان داد که کاست ژنی مورد نظر به درستی کلون شده است. با توجه به نقش ناحیه -Nترمینال ژن IpaD که یک ایمنوژن بسیار قوي و یک ناحیه عملکردي بسیار مهم در بروز شیگلوز میباشد میتوان این آنتیژن را با ایمنوادجوانت RTB ممزوج نموده و در میزبانهاي مختلف مورد مطالعه قرار داد. پروتئینهاي تولید شده میتواند به عنوان کاندید واکسن علیه بیماري شیگلوزیز استفاده شود.
-1مقدمه:
امروزه تحقیقات فراوانی بر روي واکسنهاي خوراکی با توجه به مزیتهایی که دارند، صورت میگیرد. استفاده از این واکسنها داراي محدودیتهایی است که از آن جمله میتوان به ایجاد تحمل خوراکی و کارا نبودن، هضم و تخریب ساختار واکسن در دستگاه گوارشی، استفاده از دوز دقیق این واکسن به منظور جلوگیري از ایجاد تحمل اشاره کرد. به این منظور، استراتژيهاي مختلفی در حال تحقیق و توسعه است که میتوان به تغییر شیمیایی واکسنهاي پروتئینی، طراحی حاملین اختصاصی، بکار گیري مهار کنندههاي آنزیمهاي گوارشی، افزایش ترکیبات و تقویت کننده جذب ، پلیمرهاي متصل شونده به موکوس گوارشی و استفاده از پاتوژنهاي گوارشی دستکاري شده براي حمل این واکسنها اشاره کرد.
بنابراین، یکی از راههایی که به ما در این امر کمک میکند، استفاده از آنتی ژنهایی است که خاصیت ادجوانتی و تحویل دهندگی به سلولهاي مورد نظر را دارد. امروزه براي تهیه واکسنهاي خوراکی در سطح وسیعی در جهان بر روي ژنهاي انتقال دهنده و ادجوانت از جمله RTB کار میشود. RTB از خانواده لکتین ها بوده و تمایل زیادي براي اتصال به قند گالاکتوز و –N استیل گالاکتوزآمین موجود در گلیکوپروتئین ها و گلیکولیپیدها در سطح سلولها دارد. تحلیل توالی DNA ریسین که از توالی ژنومی جداسازي و کلون شده بود، نشان داد که این ژن یوکاریوتی فاقد اینترون است.
عدم وجود اینترون سبب افزایش توجه دانشمندان به بررسی این لکتین گیاهی به منظور بیان آن در پروکاریوت ها گردید - 4و. - 5 امروزه مقالات بسیاري از فیوژن کردن RTB با یک آنتی ژن کاندیداي واکسن و بیان آن در باکتري و سپس گیاهان دیده میشود، که حاکی از اهمیت این پروتئین به عنوان یک حامل و تحویل دهنده در واکسنهاي خوراکی است - . - 6 شیگلوزیز عفونت حاد رودهاي با میزان شیوع سالیانه 164/7 میلیون نفر در دنیا 163/2 - میلیون در کشورهاي در حال توسعه - ومرگ بیش از 1/1 میلیون نفر میباشد که به علت نبود یک واکسن علیه آن و همچنین مقاومت آنتی بیوتیکی، به عنوان یک عامل بیوتروریستی قوي شناخته میشود.
علائم عفونی شیگلا شامل اسهال، تب، حالت تهوع، استفراغ، گرفتگی و درد شکمی، خون و موکوس یا چرك در مدفوع میباشد - 7و. - 8 علامت تشخیص شیگلوزیز در بیشتر بیماران بر اساس خون و مدفوع میباشد. نوتروفیلهایی که در اسمیرهاي مدفوع مشاهده میشود یک علامت تشخیصی قوي است و در اثر دیسانتري روزانه 200-300 میلیگرم پروتئین سرم داخل مدفوع از دست میرود. یکی از مهمترین فاکتورهاي بیماريزاي موجود درشیگلا ناحیه -Nترمینال ژن IpaD میباشد. این پروتئین یک ایمنوژن بسیار قوي میباشد که توسط سیستم ایمنی فرد آلوده به شیگلا شناسایی میشود - . - 9 ناحیه -Nترمینال ژن IpaD را به عنوان یک آنتی ژن کاندیداي واکسن بر علیه شیگلوزمی توان با RTB فیوژکرد.
در این تحقیق کاست ژنی ناحیه -Nترمینال ژن RTB-IpaD که داراي لینکر GPGPمی باشد را در وکتور بیانی pET-28a - + - همسانه سازي کردیم و در ادامه بررسی بیان این کاست ژنی در سویهRosetta اشرشیاکلی انجام گرفت. در ادامه این تحقیق میتوان با قرار دادن این کاست ژنی در وکتور گیاهی و ترانسفورم آن به کلروپلاست گیاه، بیان آن را بررسی کرد. فیوژن پروتئین تولید شده که یک مولکول ایمنوژن است و به نظر میرسد در بهبود و کنترل بیماري شیگلوز از طریق القا ایمنی و تحریک سیستم ایمنی نقش دارد و میتواند به عنوان کاندید واکسن بیماري شیگلوزیز استفاده شود. امروزه توجه خاصی به تولید این نوع واکسن شده است که علاوه بر نو ترکیب بودن، از طریق فعالسازي ایمنی موکوزال، در هدفدار کردن پاسخهاي ایمنی مناسب موثر هستند.
-2 مواد و روشها:
.1-2 تایید حضور ژن RTB-IpaD در :pGEM-T Easy با توجه به نوع طراحی، کاست ژنی RTB با لینکر GPGP در وکتور، همسانه سازي و در ادامه قطعه IpaD به آن اضافه شد. واکنش PCR با استفاده از پرایمرپیشرو RTBوپیروIpaD انجام گرفت. سکانس پرایمر پیشرو و پیرو کاست عبارت بودند از:
.2-2 آماده سازي محصول برش آنزیمی و پلاسمیدي : براي انجام زیر همسانه سازي ابتدا واکنش هضم آنزیمی با آنزیم SalΙو HindΙΙΙ برروي پلاسمید هاي نوترکیب pGEM-T Easy و پلاسمید وکتور بیانی pET-28a - + - انجام گرفت. پس از هضم آنزیمی محصول برش خورده از روي ژل آگاروز با دماي پایین %1 به وسیله کیت استخراج DNA تخلیص گردید.
.3-2 الحاق والکتروترانسفورماسیون: براي الحاق کاست ژنی به وکتور pET-28a - + - از آنزیم T4 DNA Ligase ساخت شرکت فرمنتاز استفاده شد. محصول الحاق، با روش الکتروترانسفورماسیون به سلولهاي باکتریائی مستعد شدهE. coli سویه Rosetta ترانسفورم گردید و بر روي محیط کشت LB جامد حاوي کانا مایسین وکلرامفنیکل کشت داده و در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد.
.4-2 بررسی بیان سازه ژنی : pET28a - RTB-IpaD براي بررسی بیان کاست ژنی pET28a - RTB-IpaD با 3 کمیت غلظتIPTG، زمان و دماي القاي بیان انجام گرفت.
-3 نتایج: پس از استخراج پلاسمید هاي نوترکیب، واکنش PCR برروي آنها انجام و محصول آن بر روي ژل آگاروز مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج واکنش PCR از پلاسمید هاي نوترکیبpGEM-T Easy که در شکل - 1 - مشاهده میشود، نشان داد که قطعه بدست آمده با کاست ژنی 1157 bpهم خوانی دارد. شکل:1 الکتروفورز محصولPCR با آنزیم Taqپلی مراز به منظور تایید حضور کاست ژنی RTB- N terminal of IpaDدر پلاسمید هاي نوترکیبpGEM-T Easy بر روي ژل آگاروز 1درصد، ستون 3 مارکر 100 تا 3000 bp، ستون 1و2 محصول .PCR ساختار RTB-Linker GPGP-N terminal of IpaD به همراه سایتهاي برشی به صورت زیر میباشد. این ساختار به طور کامل تعیین توالی گردید.
پس از الحاق قطعه مورد نظر در ناقل بیانی، عمل الکتروترانسفورماسیون درمیزبان انجام شد. براي تایید عمل زیر همسانه سازي در وکتور pET28a - + - ، واکنش PCR صورت گرفت و پس از آن براي تایید بیشتر واکنش هضم آنزیمی با دوآنزیم HindΙΙΙ انجام و کاست مورد نظر از پلاسمید جدا گردید. .در شکل 3 نتیجه هضم آنزیمی پلاسمید هاي نوتر کیب مشاهده میشود. شکل:3الکتروفورز محصول هضم آنزیمی کاست ژنی RTB- N terminal of IpaDدر پلاسمید هاي نوترکیب - pET28a - + باآنزیم هاي SalΙو HindΙΙΙ میباشد. بر روي ژل آگاروز 1درصد ، ستون 2 کاست ژنی مورد نظر، تشکیل باند 1157جفت بازي تایید کننده انجام زیرهمسانه سازي است، و ستون 1 مارکر 100 جفت بازي تا 10Kb میباشد .
