بخشی از مقاله
چکیده
با رشد صنایع مختلف میزان آلودگی به فلزات سنگین افزایش یافته و اثرات زیست محیطی آنها نیز رو به گسترش است. به کارگیري میکروارگانیسم ها به منظور حذف آلاینده هاي فلزي یکی از چشم اندازهاي بیوتکنولوژي میکروبی است. در این میان اکتینومایست ها که جمعیت بزرگی از باکتري هاي خاك را تشکیل می دهند با توانمندي هاي بالاي زیست فناوري خود مورد توجه ویژه قرار دارند. در این پژوهش 12 نمونه از خاکهاي آلوده به فلزات سنگین از مناطق مختلف استان همدان مورد غربالگري قرار گرفت که در مرحله اول 70 سویه در محیط کشت MGA-SE - فاقد فلز سنگین - جداسازي و خالص شد. در مرحله دوم با استفاده از محیط کشت تغیییر یافته MMagar داراي غلظت هاي1 تا 20 میلی مولار سرب، 11 سویه برتر که توان مقاومت به 4mM فلز سرب را دارا بودند جداسازي شد.
در مرحله غربال گري ثانویه 8 سویه برتر انتخاب و میزان مقاومت به فلزات Ni، Cd ¡ Cu ، Zn و Pb به روش میکرودایلوشن سنجیده شد .در این پژوهش بیشترین مقاومت مربوط به فلز Zn در UMTC 01519 UTMC01520 دو سویه به میزان 100mM و بیشترین مقاومت به Cd در سویه UTMC 01524 و به میزان 1/5 mM بوده است. در هر صورت مقاومت به کادمیوم در مقایسه با دیگر فلزات کمتر بوده است. این نتایج ضمن نشان دادن توانمندي اکتینومایستها براي حذف فلزات، نشان می دهد که مقاومت به یک فلز سنگین، نمی تواند الزاماً نشان دهنده مقاومت به فلز سنگین دیگر باشد.
مقدمه
فلزات سمی بر انسان و محیط زیست اثرات ناگوار زیادي دارند . - 4 - کادمیم باعث بیماري مزمن ریوي و سرطان و بیماري ایتاي ایتاي، اثر بر استخوانها و مفاصل و درد شدید در آنها می شود . این فلز با جایگزین شدن به جاي کلسیم باعث پوکی و نرم شدن بافت استخوان می گردد. میزان جذب مس در مجاري معده و روده بستگی زیادي به حالت شیمیایی این فلز و ترکیبات آن دارد. در مسمومیت هاي شدید ناشی از فلز مس نکروز کلیه ها، مردگی بافت، تصلب بافتها و سیروز کبدي ایجاد می گردد . بر اساس تقسیم بندي برنامه سم شناسی ملی آمریکا - NTP - نیکل و ترکیبات آن جزء عوامل سرطان زا محسوب می شوند . بیش از% 90 سرب استنشاق شده مستقماًی جذب خون می گردد و سپس در بافتهاي نرم - کلیه ها، مغز و ماهیچه ها - و استخوان رسوخ می کند.
افراد بزرگسال حدود % 95 کل سرب موجود در بدن را به استخوانها منتقل میکنند . - 7 - افزایش روي در محدوده 100-300mg/day با کم خونی سلولی همراه است و منجر به کاهش جذب مس میشود . - 4 - براي حذف فلزات سنگین از محیط در صنایع از روشهاي مختلفی شیمیایی و فیزیکی استفاده می کنند، که از جمله می توان به رسوب دهی شیمیایی، فیلتراسیون، تیمارهاي الکتروشیمیایی، تبخیر و استخراج محلول، الکترولیز، تعویض یونی، جذب، استفاده از غشاهاي جداساز - دیالیز - ، اکسیداسیون و احیاء اشاره کرد . بیشتر این روشها در مقیاس بزرگ صنعتی هزینه بر می باشند. در همین رابطه روش هاي زیستی نیز به کار برده شده اند. به عنوان مثال" می توان به جذب زیستی، تجمع زیستی و رسوب دهی زیستی اشاره کرد.
- 3 - میکروارگانیسمها مکانیسم هاي متفاوتی براي مقابله با فلزات سنگین دارند از جمله این مکانیسم ها می توان به کاهش نفوذ پذیري، کاهش حساسیت سلولی به یونهاي فلزي، تجزیه خارج سلولی، شارژ الکتریکی سطح باکتري، تجزیه بیرون سلولی، جذب توسط پروتئین داخل سلولی، استفاده آنزیمی، تبخیر - 3 - ، متالوتیونین ها - 2 - ، متیلاسیون و سیستم خروج فلزات - 6 - اشاره کرد. در یک مطالعه از اکتینومایست، کپک و مخمرها براي جذب زیستی یونهاي فلزي Zn، Co و Ni استفاده شده است. در این پژوهش نشان داده شده که بیوماس غیر فعال باکتري Streptomyces می تواند توانایی جذب بالایی داشته و بارها به کار می رود . - 12 - این پژوهش با هدف یافتن اکتینومایست هاي مقاوم به فلزات سمی از خاکهاي آلوده به فلزات سمی منطقه همدان انجام شده است.
مواد و روشها
با توجه به گستردگی مناطق آلوده به فلزات سمی در ایران که شرایط مطلوب را براي غنی سازي طبیعی میکروارگانیسمهاي مقاوم به فلزات سمی فراهم می سازد و نظر به اهمیت فراوانی اکتینومایست ها در خاك در این پژوهش این میکروارگانیسم ها از خاکهاي آلوده و برخی مناطق دیگر استان همدان غربالگري و جداسازي شده است. نمونه برداري از 8 منطقه با میزان آلودگی مشخص وبا استفاده از یافته هاي خاك شناسی جلالی و خانلري - 2008 - در اواخر زمستان 1388 و اوایل بهار 1389 از عمق 5-3 سانتیمتري خا کهاي استان همدان انجام شد . - 8 - مکانهاي مهم نمونه برداري شامل خاکهاي اطراف کارخانه هاي الیاف صنعتی، معدن سرب و روي، کارگاه آبکاري فلزات، اطراف نیروگاه برق، پساب شهري، خاك مزارع آلوده بوده است.
پس از اندازه گیري pH نمونه ها، خاکها را چند روز در هواي محیط قرار داده تا رطوبت آنها گرفته شود. جهت تسهیل جداسازي اکتینومایست ها پس از انجام تیمار حرارتی 120° C به مدت 10 دقیقه، نمونه ها در محیطMGA-SE کشت و در دماي C 28° به مدت 1-2 هفته گرما گذاري شد . - 6 - جدایه هاي اکتینومایستها بر روي محیط ISP2 خالص شد . - 6 - به منظور غربالگري اولیه و یافتن جدایه هاي مقاوم به فلزات سمی از محیط داراي غلظت هاي 1- 20 mM استات سرب و محیط MMAgar اصلاح شده استفاده به مدت 8 هفته در دماي 28° C گرما گذاري شد.
سویه هاي قادر به رشد در غلظت نهایی 4mM و بالاتر، جهت مطالعات فراتر درغربالسازي ثانویه انتخاب شدند. به این منظور غلظت 1/5 ×108 در هر ml جدایه ها در محیط MMbroth کشت و حداقل غلظت بازدارنده فلزات شامل نیکل - 1-120 - mM، مس - 0/15 -20 - mM، کادمیوم - 0/02 -10 - mM، سرب - 0/62 -80 - mM و روي - 1/5 -200 - mM تلقیح و حداقل غلظت بازدارنده رشد فلزات فوق براي هر جدایه مشخص شد . - 12 -
نتایج
از 12 نمونه خاك جمع آوري شده با استفاده از محیط70 MGA-SE جدایه اکتینومایست بر اساس خواص مورفولوژیک و شکل کلنی، جداسازي و در محیط ISP2 خالص شد. با استفاده از محیط MMA اصلاح شده داراي غلظتهاي مختلف فلزات سمی، 11 جدایه داراي مقاومت به غلظت 4 mM سرب به دست آمد. طی غربالگري ثانویه این جدایهها با استفاده از محیط MMB، 8 سویه برتر به شرح زیر شناخته شده و در مرکز کلکسیون میکروارگانیسمهاي دانشگاه تهران ثبت و نگهداري شدند. سویه Actinomycete UTMC01518 از خاك - آلوده - کشاورزي با 8/1 pH جداسازي شد. رنگ کلنی کرم- شکلاتی و رنگ اسپورهاي این سویه خاکستري دودي تیره، اسپورها بسیار متراکم و پودري بوده و اندازه کلنیها به قطر 3- 2 میلی متر وفاقد پیگمان محلول در آب است.
رشد این سویه در محیط جامد سریع و پس از 3-4 روز تکمیل شده است. در این جدایه، میزان مقاومت به فلز روي بالا و معادل 50 میلی مولار و براي فلزات سرب و نیکل متوسط و به ترتیب معادل 2/5 و 3/75 میلی مولار است. سویه Actinomycete UTMC01519 نیز از همان خاك - آلوده - کشاورزي قبلی جداسازي شده است. رنگ اسپورها خاکستري روشن با تراکم بالا و بسیار پودري، قطر کلنیها 5-4میلی مترو رنگ کلنیها کرم -خاکستري ومیسلیوم زمینی متراکم است. رشد این سویه نیز پس از 3-4 روز تکمیل شد.
در این جدایه، میزان مقاومت به فلز روي بالا و معادل 100 میلی مولار و براي فلزات سرب و نیکل متوسط و به ترتیب معادل 3 و 3/75 میلی مولار است. سویه Actinomycete UTMC01520 نیز از همان خاك کشاورزي جدا شد. این سویه اسپورهاي بسیار پودري داشته، رنگ اسپورها خاکستري - قهوه اي و میسلیوم زمینی متراکم و قهوه اي رنگ است. کلنی هاي تک و برجسته و ناتوان در تولید پیگمان محلول است. این سویه نیز کلنی هاي بزرگ و به قطر 3-2 میلی متر دارد. در این جدایه، میزان مقاومت به فلز روي بالا و معادل 100 میلی مولار و براي فلزات سرب و نیکل متوسط و به ترتیب معادل 3 و 5 میلی مولار است. سویه Actinomycete UTMC01521 ازخاك اطراف کارگاه آبکاري فلزات جدا شد.
این جدایه داراي خصوصیات خاصی شامل تولید بسیار بالاي پیگمان محلول در آب به رنگ بادمجانی تیره است. رنگ اسپورها ابتدا سبز و در مرحله تکامل اسپوري به رنگ سفید متمایل می شود. اسپورهاي بسیار انبوه تولید کرده و در عرض 48 ساعت دوره رشد این سویه تکمیل می شود و قطر کلنی 3-2 میلی متر می باشد. در این جدایه، میزان مقاومت به فلز روي بالا و معادل 50 میلی مولار و براي فلزات سرب و نیکل متوسط و به ترتیب معادل 2/5 و 7/5 میلی مولار است. سویه Actinomycete UTMC01522 و سویه Actinomycete UTMC01523 هر دو از خاك پساب شهري جدا شده اند. رنگ سویه Actinomycete UTMC01522 کرم – قهوه اي و رنگ اسپور خاکستري ابري است. در این جدایه، میزان مقاومت به فلز نیکل بالا و معادل 7/5 میلی مولار است.
سویه Actinomycete UTMC01523 داراي رنگ کلنی قهوه اي زرشکی و اسپور گچی و رنگ کلنی خاکستري –قهوه اي است. در این جدایه، میزان مقاومت به فلز مس متوسط و معادل 2/5 میلی مولار است. سویه Actinomycete UTMC01524 ازخاك اطراف جاده همدان- تهران - چهارباغ آیت ا... نجفی - جدا شد. کلنیها کوچک و سوزنی بوده ،رنگ اسپورها صورتی بسیار کم رنگ وبا تراکم متوسط و میسلیوم زمینی نرم و به راحتی از سطح پلیت جدا میشود.
در این جدایه، میزان مقاومت به فلزات نیکل و کادمیوم بالا و به ترتیب معادل 15 میلی مولار و 1/25 میلی مولار است.سویه Actinomycete UTMC01525از اطراف نیروگاه برق –آبی شهید مفتح همدان جدا شد این سویه کلنی هاي متراکم و سفتی داشته و رنگ میسلیوم زمینی آن قرمز و رنگ اسپورهاي آن صورتی گل بهی می باشد قطر کلنی ها متوسط و به اندازه 2-1 میلی متر دیده شد. در این جدایه، میزان مقاومت به فلز نیکل بالا و معادل 30 میلی مولار و مقاومت به روي 50 میلی مولار و مقاومت نسبت به مس1/25 میلی مولار دیده شد.
بحث
در منطقه همدان به علت داشتن معادن فلزي مختلف، می توان نقاط متعدد داراي آلودگی بالا به فلزات سمی را یافت. در این پژوهش با استفاده از مطالعات خاك شناسی جلالی و همکاران - 8 - - 2008 - جدایه هاي اکتینومایست مقاوم به فلزات سمی به دست آمد. بیشترین مقاومت نسبت به Zn و کمترین مقاومت به فلز Cd مشاهده شد. در پژوهش Schmidt و همکاران - 2009 - که بر روي استرپتومیستهاي مختلف انجام شده نیز حداکثر میزان مقاومت به روي میزان 100 mM بوده است .
