بخشی از مقاله
چکیده
خاک یکی از منابع مهم و ارزشمند موجود در طبیعت است. برنامهریزی برای داشتن خاکی سالم و تولید کننده، لازمه بقای انسان است. آفتکشهای شیمیایی از مهمترین آلایندههای محیط زیست بهویژه خاک هستند. ورود این ترکیبات به طبیعت، به سبب سمی بودن، ایجاد جهش و سرطانزایی برای موجودات زنده، از مهمترین نگرانیهای حامیان محیط زیست میباشند. آفتکشهای فسفره آلی از جمله آفتکش دیازینون با توجه به کاربرد وسیعی که در کشاورزی دارند همواره منابع غذایی ، آب آشامیدنی، و حتی هوا را در معرض خطر آلودگی قرار میدهند. مسمومیت و مرگومیر ناشی از این عوامل در سراسر جهان روبه گسترش است.
بنابراین آشکارسازی و پالایش به موقع و دقیق این عوامل برای مقاصد حفاظت از محیط زیست حائز اهمیت است. این پژوهش با هدف شناسایی باکتریهای تجزیه کننده آفتکش دیازینون از خاکهای آلوده انجام شده است. به این منظور از خاک-های آلوده به آفتکش دیازینون نمونه برداری انجام شد. پس از آماده سازی نمونههای خاک و کشت آنها در محیطهای کشت، باکتریهای رشد یافته خالصسازی گردیدند و پس از سازگاری و غنی سازی باکتریها، شناسایی باکتریها بوسیله ویژگیهای مرفولوژیکی و تستهای متداول بیوشیمیایی صورت گرفت که جدایه های باکتریایی بر اساس آزمونهای بیوشیمیایی انجام گرفته جز باکتریهای سودوموناس بودند.
کلمات کلیدی: باکتری، تجزیه زیستی ، زیست پالایی، دیازینون
مقدمه
خاک یکی از منابع مهم و ارزشمند موجود در طبیعت است،برنامهریزی برای داشتن خاکی سالم و تولیدکننده لازمه بقای انسان است،این منبع حیات با کاربرد مستقیم و غیرمستقیم آلایندهها آلوده میشود،یکی از این آلایندهها آفتکشها هستند.[1] سرعت زیاد فرآیند صنعتی شدن همراه با افزایش روزافزون جمعیت، همچنین توسعه کشاورزی و تنوع آفات گیاهی منجر به طیف گسترده ایی از مواد شیمیایی از جمله آفتکشها در محیط زیست شده است .[2] امروزه در سراسر دنیا تلاشهای گستردهای به منظور یافتن و بکارگیری فنآوریهای جدید برای حذف و یا کاهش آلایندهها از محیطزیست صورت میگیرد.روشهای معمول حذف آلایندهها - دفن، بازیافت، سوزاندن - خود دربردارنده اثرات سو بوده و از طرفی نیاز به صرف وقت و هزینههای زیادی دارد.[3]
یکی از روشهای مناسب برای حذف آلایندهها از نواحی آلوده، زیست پالایی میباشد. بهرهبرداری از توانایی میکروارگانیسمها، به عنوان یک روش جایگزین، موثر، کمخطر، مقرون به صرفه و دوستدار محیطزیست را زیست پالایی میگویند.[4] در روشهای زیست پالایی انتخاب زیست توده از جهت فراوانی در محیط و کم بودن هزینهها از اهمیت بالایی برخودار است. بسیاری از آلودگیها توسط شماری از باکتریها قابل پاکسازی میباشند.[5] افزایش روزافزونجمعیت جهان و محدودیتهای زمینهای مستعد کشاورزی سبب گردید. تا انسان برای تأمین نیازهای غذایی خود به ابزار وفناوریهای نوین روی آورد. به همین منظور استفاده از کودهای شیمیایی و سمهای مختلف آفتکش جهت افزایش راندمان زمینهای کشاورزی رایج شده است .[6]
در حال حاضر گستردهترین حشرهکشهای مورد استفاده در جهان به گروه فسفرههای - ازجمله دیازینون - تعلق دارند. ارگانوفسفرهها به استر آلی اسید فسفریک یا پنتوفسفریک گفته میشوند که ازفعالیت آنزیم استیل کولین استراز جلوگیری میکنند که سبب اختلال در عملکرد سیستم عصبی شده و در نهایت سبب مرگ میگردند. این ترکیبات به شکلهای مختلف از جمله حشرهکشها، به طور وسیعی در بخش کشاورزی و کنترل آفات خانگی استفاده میشوند.[7] بیش از 38 درصد از کل آفتکشهای مورد استفاده در سطح جهان از نوع ترکیبات ارگانوفسفره هستند.فقط در آمریکا سالانه بیش از 40 میلیون کیلو از این ترکیبات استفاده میشود.[8] استفاده بیرویه انسان از منابع طبیعی و روند روبه افزایش استفاده از آفتکشها، به یکی از مشکلهای عمده محیطزیست در عصر حاضر تبدیل شده است.
مسمومیتها با ترکیبهای فسفره آلی یک مشکل بهداشت جهانی محسوب شده و سالیانه حدود سه میلیون مسمومیت و 20 هزار مرگ براثر آن با این ترکیبها گزارش شده است.[9] دیازینون - o-o دی اتیل -2 - Bایزوپروپیل-6 متیل -4 پیریمیدینیل - تیوفسفات - درواقع نوعی حشرهکش ارگانوفسفره میباشد که در کشاورزی به طور گسترده بهکار برده میشود. نگرانیهای زیستمحیطی اولیه در ارتباط با استفاده از آن در از بین بردن پرندگان، آلودگی آبهای سطحی و اثرات مخرب بر روی گونههای آبزی مد نظر است.دیازینون و متابولیتهای آن در طول مطالعات هشدار دهنده در مورد سیستمهای آبزی مختلف در سراسر جهان مورد توجه واقع بودهاند.[10] دیازینون دارای حلالیت محدود آب برابر 68,8 میلیگرم در لیتر در 20 درجه میباشد.
در حالی که مقادیر تجربی KOC متفاوت بوده و در محدوده180 تا 430 میلیلیتر/کیلوگرم میباشد.این مقادیر این مفهوم را میرسانند که انتظار نمیرود دیازینون به شدت به خاک محدود شود.و به طور متوسط در خاک دارای تحرک بالایی است .[11] دیگر حشرهکشهای ارگانوفسفره از قبیل مالاتیون، بروموفوس، متیلپاراتیون و... میباشند که در طی 40 سال گذشته به طور وسیعی در بخشهای مختلف کشاورزی ایران مورد استفاده قرار گرفتهاند در نتیجه بررسی خزانهی ژنی میکروارگانیسمهایی که قادر به تجزیهی این ترکیبات و حذف آنها از محیط میباشند دارای اهمیت است. شناسایی این منابع و استفاده از آنها به منظور افزایش کیفیت محصول کشاورزی استراتژیک و حذف آلودگی از محیطزیست میتواند راه را در آینده برای پیشرفت، چه درزمینهی مطالعه و تحقیق مهندسی ژنتیک و چه در زمینهی اقتصادی هموار سازد.[12] هدف از این پژوهش جداسازی وشناسایی باکتریهای بومی تجزیه کننده آفتکش دیازینون از خاکهای آلوده به آفتکش دیازینون بود.
مواد و روشها
نمونه برداری
نمونه برداری خاک از منطقههای آلوده به آفتکش دیازینون، به ویژه زمینهای کشاورزی که مدت زمان زیادی از این آفتکش استفاده شده است انجام گرفت. نمونههای خاک از مزارع برنج استان گلستان از عمق3-0سانتیمتری خاک برداشته شد. نمونهها در ظروف پلاستیکی دربدار استریل جمعآوری و بلا فاصله با حفظ شرایط 4 درجه سانتیگراد به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه ولی عصر - عج - رفسنجان منتقل شد. از دستگاه جی پی اس - GPS - برای تعیین موقعیت جغرافیایی ایستگاهای نمونه برداری انجام شد.
مواد شیمیایی مورد استفاده
مواد و ترکیبهای مورد استفاده در این آزمایش با خلوص تجزیهایی مناسب از شرکتهای معتبر خریداری شد. دیازینون از شرکت تولید کننده فراوردههای شیمیایی ایران تهیه گردید. ترکیبی از نمکهای معدنی - در تهیه محیط کشت - و محیط کشت1KB از شرکت Merk خریداری شد.غنی سازی، جداسازی و خالص سازی باکتریهای تجزیه کننده دیازینونمحیط کشت نمک معدنی2 شامل 2 گرم سولفات آمونیوم1,5 3 گرم فسفات سدیم4 ، 1,5 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات5 ، 2 گرم سولفات منیزیم آبدار,6، 1 گرم کلرید کلسیم آبدار7 ، و 1 گرم سولفات آهن آبدار8 در هر لیتر آب مقطر باPH=7 تهیه گردید. و به طور متوسط در 121 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه اتوکلاو شد5 .[13]
گرم از نمونههای خاک را در ارلنهای جداگانه که حاوی 100 میلی لیتر محیط کشت بود ریخته شد. و به منظور جداسازی باکتریهای مقاوم به دیازینون از سایر باکتریها، غلظت معینی از دیازینون به میزان 50 میلی گرم بر کیلوگرم به هر ارلن اضافه شد و سپس ارلنها به مدت 10 روز در انکوباتور شیکر دار در دمای 28 درجه سانتی گراد و در دور 150rpm اتوگذاری شدند. بعد از 10 روز رقتهای مختلف نمونه خاک تهیه و روی محیطKB - طبق دستورالعمل کارخانه سازنده - به روش آمیخته کشت داده شدند، و سپس جداسازی و به روش کشت خطی خالص سازی گردیدند.انتخاب سویههای پرقدرت از میان کلیه سویههای جدا شده پس از جدا نمودن سویههای باکتریایی، به منظور غربال بهترین و قویترین سویهها، آنها را در محیط کشت آبر حاوی 1
