بخشی از مقاله
چکیده
این پژوهش به منظور جداسازی و غربالگری باکتریهای مقاوم به آرسنیک پنج ظرفیتی و تعیین برخی از خصوصیات محرک رشدی آنها انجام شد. بر اساس شکل ظاهری کلنیها، تعداد 15 جدایه متفاوت انتخاب و جهت ارزیابی مقاومت جدایهها، میزان رشد آنها در غلظتهای 0، 250،150و 500 میکروگرم در میلی لیتر آرسنیک بررسی گردید. جدایههای mh1، mh2، mh4، mh5، mh6، mh8، mh9، mh10، mh11 و mh12 در بالاترین غلظت اعمال شده آرسنیک 500 - میکروگرم در میلی لیتر - قادر به رشد بودند، در صورتی که جدایههای.mh3، mh7، mh13، mh14 و mh15 توانایی رشد درغلظت بالاتر از 150 میکروگرم در میلیلیتر آرسنیک را نداشتند.
بر اساس نتایج حاصل از آزمون حداقل غلظت بازدارندگی، تعداد 10 جدایه برتر انتخاب و برخی از صفات محرک رشد آنها تعیین گردید. ارزیابی صفات محرک رشد جدایهها مشخص کرد که جدایههای mh9 با مقدار 255 میلیگرم در لیتر حل کنندگی فسفر، mh3 و mh6 با مقدار 1/37 میلیگرم در لیترحلکنندگی ترکیبات نا محلول روی، mh9 با تولید 4/35میلیگرم در لیتر اکسین و mh10 با نسبت 1/97 قطر هاله به کلنی درتولید سیدروفور و تولید مقدار متوسط سانید هیدروژن برترین باکتریها را در باب صفت محرک رشد مذکور را تشکیل دادند.
واژههای کلیدی: آرسنیک، باکتریهای مقاوم به آرسنیک ، صفات محرک رشد گیاهی
-1 مقدمه
در جهان امروز افزایش جمعیت، پیشرفت علم و تکنولوژی باعث افزایش فعالیتهای صنعتی و کشاورزی و متعاقب آن موجب افزایش تولید مواد آلایندهی محیطزیست گردیده است. آلایندهها از جمله عوامل مختل کننده محیط زیست بهشمار رفته و از میان آنها فلزات سنگین بهدلیل اثرات سوء آنها بر سلامتی موجودات زنده از جمله انسان حائز اهمیت شناخته شدهاند .0[Rajkumar “et al.”2010] فلزات سنگین به عنوان فلزاتی با عدد اتمی بالاتر از 20 و چگالی بالاتر از پنج گرم بر سانتیمتر مکعب تعریف شدهاند،2010@ ،.[Alloyway به طور کلی روشهای پاکسازی خاکهای آلوده به سه دسته فیزیکی ، شیمیایی و زیستی تقسیم میشوند که گاه ممکن است ترکیبی از این روشها بکار گرفته شود .> 6KDUPD"et al."2005@ گیاهپالایی - Phytoremediation - روشی مناسب جهت پاکسازی محیط از آلاینده است. . این پژوهش، به منظور جداسازی باکتریهای ریزوسفری مقاوم به آرسنیک از خاکهای آلوده، بررسی مقاومت هر یک به غلظتهای 0، 150، 250و500 میکرو گرم در میلی لیتر آرسنیک و ارزیابی صفات محرک رشدی آنها انجام شد.
-2 مواد و روش
-1-2 نمونه برداری
به منظور انجام این پژوهش، تعداد 4 نمونه خاک ریزوسفری از گیاهان بومی به همراه ریشه آنها از اراضی آلوده به آرسنیک در اطراف معدن مس سرچشمه شهرستان رفسنجان تهیه، در فلاسکهای حاوی یخ به آزمایشگاه منتقل و تا هنگام جداسازی باکتریها درون یخچال نگهداری شدند.
-2-2 غنیسازی و جداسازی باکتریهای مقاوم به آرسنیک
یک گرم خاک ریزوسفری به همراه ریشه به 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژیک افزوده و به مدت 30 دقیقه بر روی شیکر با سرعت 120 نوسان در دقیقه قرار داده شد. جهت غنیسازی و جداسازی باکتریهای مقاوم به آرسنیک ابتدا 5 میلیلیتر از سوسپانسون حاصل به 50 میلی لیتر محیط کشت BSMY حاوی 150 میکروگرم در میلی لیتر آرسنیک پنج ظرفیتی منتقل گردید. محیط کشت BSMY در هر لیتر شامل 1 گرم عصاره مخمر، 0/3گرم - NH 4 - SO4، 0/14گرم. MgSo4. 7H2O ،0/2گرم CaCl2 . 2H2O، 0/1گرم NaCl، 0/05 گرم - KH2 - PO4، 0/05گرم K2HPo4، 0/06 میلی گرم H3Bo3، 0/17 میلی گرم CoCl2. 6H2O، 0/09گرم CuCl2.2H2O، 0/1 میلی گرم - Mn - Cl2.4H2O، 0/22 میلی گرم ZnCl2 و 10 گرم گلوکز بود که در pH=7 تنظیم گردید، مراحل غربالگری و خالص سازی با کمک غلظتهای مختلف آرسنیک پنج ظرفیتی انجام شد
-3-2 بررسی مقاومت جدایهها به آرسنیک
بدین منظور جدایههای مورد مطالعه در 15 میلی لیتر محیط کشت BSMY حاوی 0،150،250و 500 میکروگرم در میلی لیتر آرسنیک پنج ظرفیتی به مدت 72 ساعت در دمای 28 درجه سلسیوس رشد داده شدند. میزان رشد باکتریها با اندازهگیری میزان جذب نور از طریق دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج 600 نانومتر تعیین گردید $SDULMLWD "et ] .[al."2013
-4-2 ارزیابی صفات محرک رشد باکتریها
1-4-2 توانایی تولید اکسین
مقدار تولید اکسین جدایهها با استفاده محلول سالکوسکی و در طول موج 535 نانومتر تعیین گردید Glick & ] .[Patten,2002
2-4-2 توانایی در حل ترکیبات نامحلول فسفر و روی
به منظور بررسی توان باکتریها در حل فسفاتهای معدنی نامحلول، از روش اسپربر [Sperber,1985] استفاده شد. برای اندازه گیری توان حل کنندگی ترکیبات کم محلول روی نیز از محیط مایع 1PKV که حاوی 1 گرم در لیتر نمک Zno میباشد
استفاده گردید
3-4-2 توانایی تولید سیدروفور
برای تشخیص توان تولید سیدروفور جدایهها از روش2CAS Agar استفاده شد.[Alexander & zuberer 1991]
4-4-2 توانایی در تولید هیدروژن سیانید
برای اندازهگیری سیانید هیدروژن ابتدا جدایهها در پلیتهای حاوی محیط 15 - TSB گرم کازئین هیدرولیز شده به طریقه آنزیمی، 5 گرم آرد سویای هضم شده به وسیله آنزیم پپسین، 5 گرم کلرید سدیم، 15 گرم آگار و 1000 میلیلیتر آب مقطر - غنی شده با گلایسین 4/4 - گرم در لیتر - کشت داده شدند. سپس یک کاغذ صافی آغشته به محلول معرف شامل کربنات سدیم 2 درصد و اسید پیکریک 0/5 درصد در داخل پلیت قرار داده شد. سپس پلیتها با استفاده از پارافیلم درز بندی شده تا از خروج گاز سیانید هیدروژن جلوگیری شود. پلیتها به مدت 120 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. توانایی تولید سیانید هیدروژن از روی تغییر رنگ کاغذ صافی از رنگ زرد اولیه - عدم تولید - به کرم - کم - ، نارنجی - نسبتا کم - ، قهوهای روشن - نسبتا زیاد - و آجری - زیاد - که به ترتیب از 1 تا 4 درجهبندی شدند.
-3 تجزیه دادهها
تجزیه دادهها با استفاده از نرم افزار آماری SAS و مقایسه میانگینها نیز به روش دانکن در سطح 5 درصد انجام شد.
-4 نتایج و بحث
-1-4 باکتریهای مقاوم به آرسنیک
جدایههای mh3، mh7، mh13، mh14 و mh15 توانایی رشد تا غلظت 150 میکروگرم در میلیلیتر آرسنیک را دارا بودند و در غلظتهای بالاتر هیچ گونه رشدی از خود نشان ندادند. سایر جدایهها توانستند در بالاترین غلظت آرسنیک یعنی 500 میکروگرم در میلیلیتر نیز رشد کنند، - جدول . - 1
-2-4 ارزیابی صفات محرک رشدی باکتریها
تجزیه واریانس صفات محرک رشدی جدایهها نشان داد که تاثیر جدایهها بر انحلال ترکیبات فسفر نامحلول در سطح 5 درصد و بر ترکیبات نامحلول روی، توانایی تولید اکسین و سیدروفور جدایهها در سطح 1 درصد تفاوت معنا داری داشتند، - جدول شماره . - 2
