بخشی از مقاله
چکیده
روش های تشخیصی مختلفی برای تشخیص انواع عفونت ها وجود دارد. عمومی ترین و متداول ترین طبقه بندی روش های تشخیصی شامل دو روش: الکتروشیمیایی و کالریمتریک می باشد. هدف از این مقاله، تشخیص ویروس آنفولانزا نوع - H1N1 - A بر روی کاغذ های زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا به روش الایزا ساندویچی می باشد. به طور معمول روش الایزا بر روی پلیت های خاص خود انجام می شود، اما در این پژوهش کل فرآیند تشخیصی بر روی کاغذ های زیست فعال انجام شد.
در مرحله اول، ابتدا فرآیند الایزا ساندویچی برای تشخیص ویروس آنفولانزا نوع - H1N1 - A بر روی کاغذ نیتروسلولز انجام شد تا از صحت و درستی این آزمایش اطمینان حاصل شود. سپس این فرآیند تشخیصی بر روی کاغذ های زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا انجام شد. همچنین بهبود هایی از نظر زمانی در روند انجام فرآیند تشخیصی بر روی کاغذ های زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا نسبت به انجام این فرآیند بر روی کاغذ های نیتروسلولز صورت پذیرفت. با موفقیت آمیز بودن هر دو روش تشخیصی می توان نتیجه گرفت که اولا روش الایزا مبتنی بر کاغذ مزیت های بیشتری نسبت به الایزا معمولی را دارا می باشد، دوما کاغذ زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا می تواند جایگزین خوبی برای کاغذ گرانقیمت نیتروسلولز باشد.
.1 مقدمه
بیماری آنفولانزا پرندگان برای اولین بار در سال 1987 توسط پرونسیتو در ایتالیا تعریف و به عنوان طاعون ماکیان شناخته شد. ویروس عامل بیماری برای نخستین بار در سال 1902 از طیور مبتلا و در سال 1933 از انسان جدا شد .[1] ویروسهای آنفولانزا بر اساس تفاوت آنتیژن در پروتئینهای داخلی نوکلئوپروتئین - NP - و ماتریکس - M - به تیپهایA ، Bو C طبقهبندی میشوند. ویروسهای تیپهای B و C از موارد بیماری انسان جدا شده و ویروسهای تیپ A موجب بروز بیماری در پرندگان، انسان و پستانداران دیگر میشوند .[2]
از اولین قطعه ژنوم ویروس پروتئین PB2 به طول 759 اسیدآمینه ساخته میشود که یک جزو مهم کمپلکس تکثیر است. این پروتئین مسئول اتصال به کلاهک pre-mRNA های سلولی است و نقش مهمی در شروع رونویسی از ژنوم ویروس دارد. از دومین قطعه ژنوم ویروس، پروتئین PB1 به طول تقریبی 757 اسیدآمینه که جزو کمپلکس پلیمراز ویروسی است، ساخته میشود. این پروتئین به هنگام طویل شدن RNA ویروس، اضافه شدن نوکلئوتیدها را نیز کاتالیز میکند .[3] پروتئین PA به طول 716 اسیدآمینه از قطعه سوم ژنوم ویروس رمزدهی میشود. این پروتئین خاصیت پروتئولیتیکی داشته و در تکثیر و رونویسی نقش دارد اگرچه جزییات عمل آن مشخص نشده است؛ ولی به نظر میرسد عمل آن سرکوب بیان ژنهای سلولی است .[4]
کاغذ زیست فعال یک بستر کاغذی یا فیبری است که اصلی ترین ویژگی آن انتخابی بودن واکنش های ترکیبات زیست فعال میباشد. معمولا کاغذهای زیست فعال متشکل از دو بخش میباشند. به تازگی کاغذ زیست فعال جذابیتهای زیادی برای گروه های مختلفی که در این زمینه فعالیت دارند، پیداکرده است؛ و اخیرا توسعه و تحولات زیادی در این زمینه موردبررسی قرارگرفته است. به عنوان مثال: دی ریسیو و یان بر روی چاپ آنزیم HRP روی سطح بسترهای کاغذی مطالعاتی انجام داده اند .[6]
الایزا یا روش ایمونولوژی مبتنی بر توانایی آنتی بادیها در تشکیل کمپلکس های بزرگ ایمنی با آنتیژن های اختصاصی است که با حساسیت آنزیمی سنجیده میشود. با ثابت کردن یک مولکول معرف - آنتیژن یا آنتی بادی - به یک سطح جامد و اتصال کوالان آن به یک آنزیم و با اندازهگیری میزان تبدیل سوبسترای بیرنگ به یک فرآورده رنگی می توان فعالیت آنزیم و به عبارتی مولکول های معرف را تعیین کرد .[7]
در این مقاله، تشخیص ویروس آنفولانزا نوع - A - H1N1بر روی کاغذ های زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا به روش الایزا ساندویچی می باشد. به طور معمول روش الایزا بر روی پلیت های خاص خود انجام می شود، اما در این پژوهش کل فرآیند تشخیصی بر روی کاغذ های زیست فعال انجام شد. در مرحله اول، ابتدا فرآیند الایزا ساندویچی برای تشخیص ویروس آنفولانزا نوع A - H1N1 - بر روی کاغذ نیتروسلولز انجام شد تا از صحت و درستی این آزمایش اطمینان حاصل شود.
سپس این فرآیند تشخیصی بر روی کاغذ های زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا انجام شد. همچنین بهبود هایی از نظر زمانی در روند انجام فرآیند تشخیصی بر روی کاغذ های زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا نسبت به انجام این فرآیند بر روی کاغذ های نیتروسلولز صورت پذیرفت. با موفقیت آمیز بودن هر دو روش تشخیصی می توان نتیجه گرفت که اولا روش الایزا مبتنی بر کاغذ مزیت های بیشتری نسبت به الایزا معمولی را دارا می باشد، دوما کاغذ زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا می تواند جایگزین خوبی برای کاغذ گرانقیمت نیتروسلولز باشد.
2-2 روش ها
1-2-2 آماده سازی بافر
1/79 گرم دی سدیم فسفات، 0/122 مونوپتاسیم فسفات، 4/003 گرم سدیم کلراید و 0/1 گرم پتاسیم کلراید با استفاده از ترازو وزن کرده و در بشر مخلوط شده و به حجم رسانده شد و با استفاده از همزن مغناطیسی با دور 950rpm به مدت 10 دقیقه هم زده شد. در انتهای محلول سازی pH محلول بافر 7/2 شد که با استفاده از سود به 7/4 رسانده شد.
2-2-2 آماده سازی محلولهای حاوی آنتیبادی و ویروس
تمامی محلولهای حاوی آنتیبادی و ویروس نیز به نسبت 1 به 1000 در محلول بافر ساخته شدند. محلول حاوی آنتیبادی مونو کلونال به مقدار 1 میکرو لیتر از این آنتیبادی در 1 میلیلیتر از بافر ساخته شد، همچنین برای ساخت محلول آنتیبادی کونژوگه مقدار 2 میکرو لیتر از این آنتیبادی به همراه 2 میلیلیتر بافر درون پلیت مخلوط شدند تا محلول آنتیبادی کونژوگه نیز ساخته شد. به دلیل جامد بودن دیامینو بنزیدین، مقدار 15 گرم از این ماده به همراه 25 میلیلیتر بافر مخلوط شد و در آخر مقدار 25 میلیلیتر آب دیونیزه شده به آن اضافه شد تا سوبسترا رنگزا دیامینو بنزیدین آماده شد.
3-2-2 تشخیص ویروس آنفولانزا - H1N1 - Aبه روش ساندویچ الایزا مبتنی بر کاغذ زیست فعال اصلاحشده با نانو ذرات سیلیکا انجام تست بر روی کاغذ G1 بر اساس الگو و ترتیب بهکاررفته در کاغذ نیتروسلولز G، این فرآیند را بر روی کاغذ زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا، انجام شد. در این آزمایش ابتدا مقدار 3 میکرو لیتر از ویروس آنفولانزا بر روی نقطه آزمایش ایجاد شده روی کاغذ زیست فعال اصلاح شده با نانو ذرات سیلیکا - G1 - ریخته شد و مطابق آنچه در روش کاغذ نیتروسلولز انجام شد، کاغذ به مدت یک ساعت درون پلیت حاوی بافر در دستگاه شیکر به منظور پوشش داده شدن سطح کاغذ با ویروس، قرار داده شد.
