بخشی از مقاله
چکیده
اخیراً تشخیص دادن بیماریها و عفونتهای مختلف در کاربردهای متفاوت باعث ایجاد آزمایشهایی به نام روشهای تشخیصی شده است. در این پژوهش تشخیص ویروس آنفولانزا H1N1 با استفاده از روش کالریمتریک و آنتیبادیها بر مبنای کاغذ نیتروسلولز بود.
علت استفاده از آنتیبادیها در این پژوهش، اختصاصی بودن اتصال آنها میباشد. هر آنتیبادی فقط به نمونه هدف مختص خود اتصال پیدا میکند و در ادامه آنتیبادی حاوی آنزیمی که به آنتیبادی اولیه متصل میشود، نیز اختصاصی عمل میکند و میتوان از انجام روند تشخیص بر روی کاغذهای زیست فعال اطمینان کامل را داشت. در این پژوهش سعی شد که روش الایزا مبتنی بر کاغذ با الایزا معمولی مورد مقایسه قرار بگیرد. بعد از بدست آمدن نتایج حاصل از این پژوهش میتوان نتیجه گرفت که به دلیل مزایای فراوان، روش الایزا مبتنی بر کاغذ میتواند جایگزین خوبی برای روش الایزا معمولی باشد.
-1مقدمه
ریشه کلمه ویروس از زبان لاتین میباشد که به معنی سم و دیگر مادههای مضر است. معنای "عامل مسبب بیماریهای عفونی " ابتدا در سال 1728 قبل از کشف ویروسها توسط دیمیتری ایوانفسکی1 در سال 1892، ثبت شد. اصطلاح ویریون که اشاره به یک ذرهی ویروسی عفونی پایدار که از سلول آزاد میشود و توانایی آلوده کردن دیگر سلولها از همان نوع را بهطور کامل دارا میباشد، نیز در سال 1959 به ثبت رسید.
ویروسهای آنفولانزا بر اساس تفاوت آنتیژن در پروتئینهای داخلی نوکلئوپروتئین - NP - و ماتریکس - M - به تیپهای A، B و C طبقهبندی میشوند. ویروسهای تیپهای B و C از موارد بیماری انسان جدا شده و ویروسهای تیپ A موجب بروز بیماری در پرندگان، انسان و پستانداران دیگر میشوند. در بین ویروسهای آنفولانزا فقط ویروسهای تیپ A بر اساس خاصیت آنتی ژنیسیته دو گلیکوپروتئین سطحی، هماگلوتنین - HA - و نورآمینیداز - NA - به تحت تیپهای مختلف طبقهبندی میشوند
آنتیبادیها پروتئینهای اختصاصی هستند که بهوسیلهی لیمفوسایت هایB تولیدشده و قادرند به طور اختصاصی به مواد خارجی متصل شوند و عملکرد مضر آنها را از بین ببرند. گرچه هر لیمفوسایت قادر است فقط یک نوع مولکول آنتیبادی تولید نمایند ولی واکنش کل ایمنی در بدن به تعداد زیاد سلولهای B بستگی دارد هر سلول آنتیبادی مخصوص به خود را تولید میکند بهطوریکه همگی واکنش دفاعی را انجام میدهند
کاغذ زیست فعال یک بستر کاغذی یا فیبری است که اصلی ترین ویژگی آن انتخابی بودن واکنش های ترکیبات زیست فعال میباشد. معمولا کاغذهای زیست فعال متشکل از دو بخش میباشند. به تازگی کاغذ زیست فعال جذابیتهای زیادی برای گروه های مختلفی که در این زمینه فعالیت دارند، پیداکرده است؛ و اخیرا توسعه و تحولات زیادی در این زمینه موردبررسی قرارگرفته است. به عنوان مثال: دی ریسیو و یان2 بر روی چاپ آنزیم 3HRP روی سطح بسترهای کاغذی مطالعاتی انجام داده اند
در این مقاله تشخیص ویروس آنفولانزا H1N1 با استفاده از روش کالریمتریک و آنتیبادیها بر مبنای کاغذ نیتروسلولز بود. علت استفاده از آنتیبادیها در این پژوهش، اختصاصی بودن اتصال آنها میباشد. هر آنتیبادی فقط به نمونه هدف مختص خود اتصال پیدا میکند و در ادامه آنتیبادی حاوی آنزیمی که به آنتیبادی اولیه متصل میشود، نیز اختصاصی عمل میکند و میتوان از انجام روند تشخیص بر روی کاغذهای زیست فعال اطمینان کامل را داشت. در این پژوهش سعی شد که روش الایزا مبتنی بر کاغذ با الایزا معمولی مورد مقایسه قرار بگیرد. بعد از بدست آمدن نتایج حاصل از این پژوهش میتوان نتیجه گرفت که به دلیل مزایای فراوان، روش الایزا مبتنی بر کاغذ میتواند جایگزین خوبی برای روش الایزا معمولی باشد.
-2 مواد و روش ها
1-2 مواد
دی سدیم فسفات - محصول شرکت مرک آلمان ، جرم مولکولی: - 358/14 gr/mol، کلرید پتاسیم - جرم مولکولی : 74/56 gr/mol، محصول شرکت اسچارلو اسپانیا،کد: - PO200، مونو پتاسیم فسفات - جرم مولکولی : 136/086 gr/mol، محصول شرکت مرک آلمان - ، تترا متیل بنزیدین - محصول شرکت سیگما، جرم مولکولی : - 240/35 gr/mol، گلوتارآلدئید - محصول شرکت تیترا چم، محلول %25 ،کد: - * 601670، سدیم کلراید - جرم مولکولی : 58/44 gr/mol، محصول شرکت مرک آلمان - ، پتاسیم کلراید - جرم مولکولی :74/56gr/mol، محصول شرکت مرک آلمان - ، آب مقطر دیونیزه - آب مقطر دو بار تقطیر شده - ، بوین سرم آلبومین - محصول شرکت سیگما، جرم مولکولی : 68 gr/mol - ، دیامینو بنزیدین تترا هیدروکلرید - محصول شرکت سیگما، جرم مولکولی : - 360/11 gr/mol، تویین بیست - محصول شرکت سیگما، جرم مولکولی : - 227/54 gr/mol ، آنتی بادی نوکلئوپروتئینی ضد ویروس آنفولانزا - مونوکلونال - - محصول آب کم انگلستان - ، آنتی بادی پروکسیداز ضد موش - محصول شرکت سیگما - ، آنتی بادی پلی کلونال ضد - NPمحصول شرکت سیگما - ، اسید سولفوریک - محصول شرکت سیگما، جرم مولکولی : - 98/079 gr/mol، سدیم هیروکسید - محصول مرک آلمان، جرم مولکولی: - 40 g/mol، ویروس آنفولانزا H1N1 A - غیر فعال شده در پاستور تهران - .
2-2 روش ها
1-2-2 آماده سازی بافر
1/79 گرم دی سدیم فسفات، 0/122 مونوپتاسیم فسفات، 4/003 گرم سدیم کلراید و 0/1 گرم پتاسیم کلراید با استفاده از ترازو وزن کرده و در بشر مخلوط شده و به حجم رسانده شد و با استفاده از همزن مغناطیسی با دور 950rpm به مدت 10 دقیقه هم زده شد. در انتهای محلول سازی pH محلول بافر 7/2 شد که با استفاده از سود به 7/4 رسانده شد.
2-2-2 آماده سازی محلولهای حاوی آنتیبادی و ویروس
تمامی محلولهای حاوی آنتیبادی و ویروس نیز به نسبت 1 به 1000 در محلول بافر ساخته شدند. محلول حاوی آنتیبادی مونو کلونال به مقدار 1 میکرو لیتر از این آنتیبادی در 1 میلیلیتر از بافر ساخته شد، همچنین برای ساخت محلول آنتیبادی کونژوگه مقدار 2 میکرو لیتر از این آنتیبادی به همراه 2 میلیلیتر بافر درون پلیت مخلوط شدند تا محلول آنتیبادی کونژوگه نیز ساخته شد. به دلیل جامد بودن دیامینو بنزیدین، مقدار 15 گرم از این ماده به همراه 25 میلیلیتر بافر مخلوط شد و در آخر مقدار 25 میلیلیتر آب دیونیزه شده به آن اضافه شد تا سوبسترا رنگزا دیامینو بنزیدین آماده شد.
3-2-2 انجام تست بر روی کاغذA
ابتدا کاغذ نیترو سلولز به ابعاد دلخواه و تعداد لازم برش داده شد و محل آزمایش با مداد مشخص شد، کاغذ مورد نظر علامتگذاری شد و در داخل پلیت حاوی محلول آنتیبادی پلی کلونال ضد - NP مقدار 5 میکرو لیتر آنتیبادی در 5 میلیلیتر بافر - قرار داده شد و به مدت یک ساعت پلیت موردنظر در داخل دستگاه تکاندهنده قرار گرفت تا بهخوبی کاغذ در محلول مورد نظر تکان داده شود تا رادیکالهای آزاد و مواد اضافی حذف شود و مواد بهخوبی بر روی بستر تثبت شود. سپس به مدت سی دقیقه درون پلیت حاوی بافر مسدودکننده درون دستگاه شیکر مطابق مرحله قبل قرار داده شد. این فرایند بهمنظور تثبیت کردن آنتیبادی اولیه بر روی سطح کاغذ انجام میشود
در ادامه فرآیند شستن انجام شد که کاغذ مورد نظر در پلیت حاوی محلول شستشو قرار گرفت و سه بار و هر بار به مدت ده دقیقه در داخل دستگاه شیکر قرار داده شد. فرآیند شستن بهمنظور شسته شدن و از بین رفتن تمام آنتیبادی آزاد و متصل نشده به کاغذ انجام شد. با استفاده از سمپلر غلظت دلخواهی از ویروس غیرفعال شده - بین 0/5 تا 5 میکرو لیتر - درون بافر ریخته شد و سپس کاغذ A درون پلیت حاوی محلول هدف قرار داده شد.
ضمن اینکه میتوان ویروس بر روی نقطه آزمایش ریخته شود و سپس کاغذ درون پلیت حاوی بافر قرار داده شود. سپس مانند مراحل قبل کاغذ داخل پلیت قرار گیرد. پلیت حاوی ویروس توسط دستگاه به مدت یک ساعت تکان داده شد. در ادامه فرآیند شستشو مطابق مرحله قبل سه بار انجام شد و پس از آن کاغذ در محلول آنتیبادی منوکلنال - حاوی 1 میکرو لیتر آنتیبادی نوکلئوپروتئینی ضد ویروس آنفولانزا در 1 میلی لیتر - قرار گرفت و به مدت یک ساعت درون دستگاه قرار گرفت تا به خوبی محلول آنتیبادی در تماس با سطح نقطه آزمایش قرار بگیرد.
