مقاله شمارش باکتری O157 : H7 Escherichia coli با استفاده از ژنهای wzyO157 و stx2B و روش Real Time PCR در آب آلوده به باکتریهای سطحی گیاه کاهو ( Lactuca sativa )

بخشی از مقاله

چکیده:

وجود باکتریهاي بیماریزا در منابع آبی و غذایی در دسترس، عامل اصلی بروز بسیاري از مسمومیتها و عفونتهاي حاد میباشد. همچنین با توجه به غیر قابل کشت بودن برخی از سویه هاي موجود در مجموعه این عوامل بیماریزا - از جمله سویههایی از E. - coli و عدم توانایی در استفاده از روشهاي وابسته به کشت در تشخیص آنها، وجود روشی دقیق، سریع و غیر وابسته به کشت براي تشخیص حضور این عوامل، در منابع آبی و غذایی گوناگون، ضروري مینماید.

معرفی روش Real time PCR به عنوان روش جایگزین و بسیار دقیقتر، سریعتر و حساستر نسبت به آزمایشات کنونی تشخیص کیفیت آب و غذا که در آزمایشگاهاي تشخیص کیفی صنایع غذایی و سازمان آب انجام میپذیرد، هدف اصلی از انجام این پژوهش است.

در این تحقیق، آغازگرهاي اختصاصی، براي ژنهاي اختصاصی بیماریزایی wzyO157 و stx2B در باکتري E. coli O157:H7 طراحی شد و به صورت PCR تکی جهت بررسی میزان حساسیت وتعیین کمیت تعداد باکتریهاي قابل شناسایی و PCR چندگانه - با استفاده از هر دو ژن - ، براي بررسی اختصاصیت کامل این ژنها انجام پذیرفت.

رنگ فلورسانت استفاده شده، SYBR Green II بود و از روش کمیت سنجی مطلق براي تخمین تعداد باکتریهاي موجود در نمونه آب آلوده به باکتریهاي جدا شده از کاهو استفاده گردید. بررسی نتایج این تحقیق نشانگر دقت، حساسیت و سرعت فوقالعادهي Real Time PCR در مقایسه با روشهاي شناسایی وابسته به کشت، وابسته به ویژگیهاي بیوشیمیایی، متابولیک و حتی ایمونولوژیک میباشد.

مقدمه:

استرینهاي ویژهاي از باکتري Escherichia coli، - مانند O157، O55، O26 و O11، - به علت وجود ژنهاي سمیت در ژنوم خود، در حالت طبیعی بیماریزا هستند و پاتوژن محسوب میشوند.E. coli O157:H7 ، یک سویهي انتروهموراجیک1 از باکتري E. coli و مولد بیماریهایی است که از طریق آب و غذاي آلوده ایجاد میشوند .[1] آلودگی توسط این باکتري، اغلب مولد اسهال خونی و برخی اوقات باعث از کار افتادن کلیهها و ابتلا به سندروم همولایتیک اورمیک - HUS - 2، میگردد.

انتقال این باکتري از طریق مسیر گوارش و مجاري ادراري و در اغلب موارد به واسطهي خوردن گوشت چرخ کردهي نیمپز آلوده، شنا کردن در آب آلوده و در کل نوشیدن آب آلوده و نیز مصرف سبزیجاتی که با آب آبیاري آلوده به این باکتري آلوده شدهاند، به ویژه کاهو و اسفناج ایجاد میگردد

در بین این روشهاي انتقال، محققان - به ویژه در کشور ما - معمولاً اهمیت کمتري براي روش انتقال با محصولات جالیزي و سبزیجات قائل بودهاند . در صورتیکه مورد اخیر از شیوع این عامل بیماریزا در بخشهاي وسیعی از اروپا و آمریکا - اواخر می و اوائل ژوئن 2011 م. - و مبتلا شدن چندین هزار نفر به عوارض مختلف ناشی از آن و مرگ بیش از 70 تن در اثر ابتلا به نارسایی کلیوي شدید ناشی از این پاتوژن، که در پی مصرف محصولات جالیزي آبیاري شده با آب آلوده به این پاتوژن به وقوع پیوست،کاملاًاهمیت و اضطرار قضیه را خاطر نشان نمود

سمیت E. coli O157:H7 به دلیل تولید محصولات پروتئینی مربوط به ژنهاي سمیت است که اصلیترین این ژنها، ژنهاي مولد سم شبیه شیگا1 است - از جمله - stx2Bکه مانع از فعالیت عادي ریبوزوم و نهایتاً مانع پروتئینسازي در سلولهاي اپیتلیال روده و مرگ آنها میشود. ژن wzyO157 نیز مربوط به خوشهي ژنی آنتیژن O است که مسئول سنتز یکی از مهمترین پروتئینهاي سطحی این استرین باکتریایی میباشد. وظیفهي اصلی این پروتئین، کمک به باکتري جهت چسبیدن به سطح سلولهاي روده است

معمولترین روش شناسایی باکتري E. coli که امروزه هم به صورت فراگیر در آزمایشگاههاي تشخیص طبی و صنایع غذایی و نیز در حالتهاي ویژه در آزمایشگاههاي کنترل کیفیت آب مورد استفاده قرار میگیرد، روشهاي وابسته به کشت، روشهاي بیوشیمیایی، روشهاي ایمونولوژیکی و MPN2 است که حتی دقیقترین و بهترین آنها به اندازه کافی و متناسب با خطرساز بودن این استرین، دقیق و حساس نیستند؛ ضمن اینکه این روشها، متضمن صرف وقت زیادي نیز میباشد.

این در صورتی است که بهترین روش کنترل و جلوگیري از شیوع بیماریهاي مربوط به این باکتري، شناسایی سریع منشأ آلودگی - لااقل در کمتر از 24 ساعت - و کنترل عوامل توزیع آن میباشد. شایان توجه است که بر خلاف بسیاري از پاتوژنهاي باکتریایی، ورود تنها 10 عدد از این میکروارگانیسم به بدن میزبان انسانی، میتواند باعث بروز علائم و نشانههاي بیماري گردد.

در بین روشهاي مولکولی تشخیص پاتوژنها که اخیراً مورد توجه قرار گرفته و گسترش یافتهاند، روش Real Time PCR، یکی از حساسترین، دقیقترین و سریعترین آنهاست که در این تحقیق با جزئیات مربوطه معرفی میگردد

مواد و روشها:

استرین خالص باکتري E. coli O157:H7، از رفرانس باکتریایی دانشکده بهداشت دانشگاه آزاد اسلامی زنجان تهیه شد و پس از کشت در محیط کشت لوریا برتانی - LB - به مدت 16 ساعت در دماي 37◦c با دور 110 rpm در اتاقک رشد، DNAي یک بخش از باکتریهاي رشد یافته به روش فنول-کلروفرم استخراج گردید.

بخش دیگري از باکتریها در تهیه رقت از باکتري - 1-10-7 - براي آلوده سازي برگهاي کاهوي معمولی مورد استفاده قرار گرفت. تکههایی از برگ کاهو پس از شستشو و ضدعفونی، به مدت 15 دقیقه با هر یک از این رقتهاي باکتریایی در تماس بودند و سپس آب اضافی آنها با صافی استریل گرفته شد و جهت جدا شدن باکتریهاي باقی مانده بر سطح برگ، تکهها در درون لوله آزمایش، در معرض آب مقطر استریل قرار گرفتند. این آب به عنوان منبع آلودگی حاوي ماده ژنتیکی، مستقیماً در واکنش تکثیر، مورد استفاده قرار گرفت.

دو ژن مورد استفاده در تحقیق حاضر، پس از بررسی میزان اختصاصیت آنها در مقالات مرجع و نیز بررسی میزان همولوژي با توالیهاي ثبت شده در NCBI، به عنوان ژنهاي کاملاً اختصاصی براي میکروارگانیسم یاد شده انتخاب شدند 3]،5،7و[8 و براي طراحی آغازگر توسط نرمافزار Beacon Designer مورد استفاده قرار گرفتند. واکنش Real-time PCR پس از واسرشت سازي اولیه در دماي 95◦c به مدت 2 دقیقه، در 40 چرخه و هرچرخه شامل 10 ثانیه واسرشته شدن در دماي 95 درجه و 30 ثانیه چسبیدن آغازگرها در دماي 60 درجه سانتیگراد انجام شد. هر 20 میکرو لیتر مواد واکنش شامل 12/5 میکرولیتر supermix SYBR Green II، 3/5 میکرولیتر آب DEPC1، 2میکرولیتر DNAي گوال با غلظت حدوداً18 نانوگرم بر میکرولیتر و 0/2 میکرولیتر 200 - میلیمولار - از هریک از آغازگرهاي ژنهاي stx2B و wzyO157 بود. این واکنش به چند روش مختلف جامان شد که ذیلاًبه آنها اشاره میگردد:

-1 واکنش با استفاده از رقتهاي تهیه شده از DNAي خالص شده از باکتري براي ژن wzyO157 انجام شد. هدف از این کار بررسی میزان حساسیت و تعیین کمیت باکتري موجود در هر یک از رقتها بود.

-2 واکنش بار دیگر براي دو ژن stx2B و wzyO157 به طور همزمان انجام گرفت - بدون استفاده از سري رقت - . هدف از انجام این آزمایش، بررسی میزان اختصاصیت و رقابت بین تکثیر دو ژن بطور همزمان میباشد.

-3 آبهاي آلوده شده به باکتري سطحی باقیمانده بر روي برگهاي کاهو پس از آلودهسازي، به عنوان الگوي تکثیر براي ژن stx2Bمستقیماً در واکنش به کار رفتند.

هدف از انجام این واکنش بررسی همزمان حساسیت و اختصاصیت، در حالت استفاده از میکروارگانیسم کامل حاوي DNA، به عنوان الگوي تکثیر است. باید توجه داشت که در این آزمون، مدت زمان اعمال دماي واسرشتسازي اولیه، جهت کافت کامل سلولها و قرارگیري DNAي ژنومی باکتري در معرض مواد واکنش تکثیر، تا 10 دقیقه افزایش داده شد. همچنین، 5 µl از آب الوده شده به روش مذکور به جاي DNA 2 µlي الگو در واکنش به کار رفت.

در تمامی واکنشها از مسترمیکس حاوي ماده فلورسانت SYBR Green II، محصول شرکت QiaGene به عنوان رنگ قابل شناسایی و ردیابی توسط دستگاه استفاده گردید.ضمناً از باکتریهایی غیراز E. coli و نیز استرینهاي Non O157:H7 از E. coli به عنوان کنترل منفی در بررسی اختصاصیت ژنهاي انتخاب شده و روش مورد آزمون، استفاده گردید که نتایج آنها در اینجا ارائه نشده است.

نتایج و بحث:

نمودار استاندارد به دست آمده براي واکنشهاي انجام شده در مورد اولین روش شرح داده شده براي Real Time PCR، نشان داد که تا رقت 10-9 به راحتی با این روش قابل شناسایی بوده و معادل 1 CFU/ml ،DNA ي باکتري مورد شناسایی قرار گرفته است. در صورتیکه نتایج بدست آمده از کشت هر یک از این رقتها، در هر یک از سه تکرار و بسته به نوع روش کشت انتخاب شده، در بسیاري موارد متفاوت و غیر قابل استناد است - شکل - 1 نتایج کشت، ارائه نشده است.