بخشی از مقاله
چکیده
مین هاي زمینی یکی از خطرناك ترین بقایاي جنگ هاي امروزي می باشند که بطور گسترده اي سلامت و امنیت بشر را تهدید می نمایند. تا کنون روش هاي متعددي براي شناسایی مین هاي زمینی پیشنهاد شده است که از این میان روشهایی که پایه زیستی دارند داریاي پتانسیل بالایی می باشند. قابلیت درك و آنالیز موثر مواد منفجره توسط گیاهان با استفاده از مهندسی ژنتیک گیاهان هدف امکان پذیر خواهد شد. هدف از این مطالعه شناسایی پروتئین هاي پاسخگو به غلضت هاي مختلف تی ان تی در گیاه جو می باشد.
با وجود اینکه در پایین ترین سطح، تی ان تی باعث افزایش رشد بافت می شود اما با افزایش غلظت رشد کاهش می یابد و در سطوح بالا مرگ بافت را در پی خواهد داشت. داده هاي حاصل از آنالیز پروتئوم نشان می دهد که از 843 نقطه پروتئینی 156 نقطه تغییر بیان نشان دادند که این تغییر شامل افزایش بیان در 19 پروتئین و کاهش بیان در 130 پروتئین بود. همچنین حضور هفت پروتئین که در شاهد حضور نداشتند به وسیله تی ان تی القا شد. ما پیشنهاد می کنیم که استفاده از یک ژن گزارشگر مهندسی شده با پروموتر ژنهاي پروتئین هاي پاسخ گو به تی ان تی می تواند منجر به تولید گیاه تراریخته اي شود که توانایی شناسایی و گزارش مین هاي زمینی را خواهد داشت.
مقدمه
مین هاي زمینی یکی از خطرناك ترین بقایاي جنگ هاي امروزي می باشند که بطور گسترده اي سلامت و امنیت بشر را تهدید می نمایند. تا کنون روش هاي متعددي براي شناسایی مین هاي زمینی پیشنهاد شده است . - Gooneratne et al., 2004 - روش هاي بیولوژیکی براي شناسایی مین هاي زمینی روش هایی حساس و دقیق، داراي پتانسیل بالا و بشردوستانه می باشند . - Habib, 2007 -
شناسایی مین با استفاده از گیاهان داراي پتانسیل بسیار زیادي می باشد . - Deyholos et al., 2006 - گیاهان نیز مانند تمام موجودات زنده به طور طبیعی توانایی درك مواد شیمیایی موجود در محیط اطراف خود را دارند. نشان دادن خطرات محیطی مانند حضور مواد سمی در محیط یکی از جنبه هایی است که مهندسی ژنتیک گیاهی می تواند در رابطه با آن نقشی حیاطی بازي کند.
. - Habib, 2007 - اولین قدم در تولید شناساگرهاي گیاهی مواد منفجره شناسایی ژن هاي پاسخگو به این ترکیبات می باشد. تاکنون روش هاي شناسایی پربازده ژن ها نظیر cDNA مایکرواري - Mentewab et al., 2004 - و - Herrero et al., 2008 - و آنالیز سریالی بیان ژن - Ecman et al., 2003 - در جهت شناسایی ژنهاي پاسخگو به تی ان تی مورد استفاده قرار گرفته است.
نقص موجود در داده هاي ترانسکریپتومیکس که عدم شناسایی تخصصی ژنهاي عملکردي می باشد را می توان با استفاده از داده هاي آنالیز پروتئوم برطرف نمود. بر مبناي اطلاعات موجود هنوز هیچ آنالیز پروتئومی در مورد پاسخ گیاه به تی ان تی صورت نگرفته است و مطالعه حاضر اولین گزارش در این زمینه می باشد. هدف از این مطالعه استفاده از روش الکتروفورز دوبعدي در جهت پیدا نمودن دسته هاي ژنی پاسخگو به تی ان تی میباشد.
مواد و روش ها
آماده سازي ماده گیاهی: بذور جو - که بر مبناي مطالعه قبلی انتخاب شده بودند - به مدت 30 ثانیه در الکل %70 و 15 دقیقه در محلول %5 هیپوکلراید سدیم استریل سطحی شده و در محیط آب-آگار %0.05 کشت شدند. بعد از 5 روز گیاهچه ها برداشت شده و کلوئپتیل ها تحت شرایط استریل از گیاهچه جدا و توزین شدندو به ارلن هاي محیط کشت مایع حاوي محیط MS و 30 گرم در لیتر شکر و غلظت هاي 0، 5، 10، 20، 40، 80 و 160 میلی گرم در لیتر تی ان تی انتقال داده شدند. ارلن ها در شیکرانکوباتور تحت شرایط دمایی 25 و تاریکی با شدت گردش 130 rpm به مدت 10 روز نگهداري شد.
استخراج پروتئین: مواد گیاهی برداشت شده به وسیله هاون و در حضور ازت مایع کاملا پودر شدند. پروتئین هر نمونه با روش Tri Reagent استخراج و در لایزیز بافر حل شد . نهایتا غلظت پروتئین توسط کیت برد فورد و سرم آلبومین گاوي به عنوان استاندارد تعیین شد. الکتروفورز ژل دو بعدي: پروتیئن هاي هر نمونه بر مبناي نقطه pH ایزو الکتریک در بعد اول و جرم ملکولی در بعد دوم از هم تفکیک شدند.
بدین ترتیب که در بعد اول 100مایکروگرم پروتیئن محلول در 350 مایکرولیتر بافر رهایدریشن جذب نوارهاي ژل آماده IPG، 18 سانتیمتري با محدوده 4 pH تا 7 گردید و با اعمال 55000 ولت-ساعت جریان الکتریکی به وسیله دستگاه ایزوالکتریک فوکوسینگ ettan IPGphore lll پروتئین ها در نقطه pH خاص خود قرار گرفتند. نوارها پس از پایان این مرحله به مدت 15 دقیقه در بافر متعادل کننده تیمار شدند.
بعد دوم به وسیله قرار دادن نوارهاي بعد اول بر روي ژل SDS-PAGE با غلظت %12.5 اکریل آمید به وسیله الکتروفورز عمودي انجام شد. پس از اتمام بعد دوم ژل ها در محلول تثبیت کننده قرار داده شدند. رنگ آمیزي ژل ها توسط روش رنگ آمیزي نیترات نقره انجام شد. ژل هاي رنگ آمیزي شده توسط Imagescaner lll اسکن شده و تصویر حاصل به وسیله نرم افزار ImageMaster 2D Platinum و بر اساس درصد حجمی نقاط آنالیز گردید.B
نتایج و بحث
نتایج داده هاي فیزیولوژیک نشان می دهد که تی ان تی در پایین ترین سطح باعث افزایش رشد بافت بر مبناي وزن تر می شود در حالی که با افزایش غلظت، تی ان تی کاهش رشد و در بالاترین سطح مرگ بافت را سبب خواهد شد. تصور بر این است، از آنجایی که تی ان تی داراي 3 اتم نیتروژن است در سطوح پایین این نیتروژن به عنوان غذا جذب گیاه شده و باعث افزایش رشد می شود.
نتایج مولکولی حاصل از آنالیز ژل ها نشان داد، از بین 843 نقطه پروتئینی شناسائی شده توسط نرم افزار، 156 پروتئین تغییر معنی دار در سطح بیان را در پاسخ به خضور تی ان تی از خود نشان داده اند. از این تعداد 19 پروتئین متناسب با افزایش غلظت پروتئین افزایش بیان نشان دادند در حالی که 130 پروتئین روندي معکوس داشتند. 7 پروتئین در سصح صفر حضوري نداشتند در حالی که در سطوح بالا در ژل ظاهر شدند. بطور کلی نتایج نشان می دهد که تی ان تی تاثیر بسیار وسیعی بر پروفایل پروتئینی اندام هوایی گیاه دارد و در غلظت هاي بال باعث مرگ گیاه می شود.
