بخشی از مقاله
چکیده
با توجه به نقش پایهاي سیتوژنتیک در بیوتکنولوژي، شناخت ویژگیهاي کاریولوژیکی در گیاهان،مخصوصاًدر گیاهان دارویی نظیر قیچ که از آن اطلاعات کمی در دسترس است، میتواند زمینه را جهت استفاده از ابزارهاي بیوتکنولوژي فراهم کند. بدین منظور بذور 8 جمعیت مختلف قیچ - Zygophyllum fabago - از بانک ژن تهیه شده و بررسی سیتوژنتیکی در مرکز تحقیقات کشاورزي و منابع طبیعی استان اصفهان انجام گرفت.به منظور بررسی سیتوژنتیکی، نمونه هاي میکروسکوپی از مریستم هاي نوك ریشه، پس از مراحل تثبیت، هیدرولیز و رنگ آمیزي تهیه شدند .
تعداد کروموزومها، طول کل ژنوم، طول بزرگترین کروموزوم، طول کوچکترین کروموزوم، میانگین بازوهاي بلند و کوتاه، میانگین نسبت بازوي بلند به بازوي کوتاه، میانگین نسبت بازوي کوتاه به بازوي بلند، اختلاف دامنه طول نسبی، مقدار کروماتین نسبی و تقارن کاریوتیپی در هر جمعیت مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج، عدد پایه کروموزومی در تمامی جمعیتهاي مورد مطالعه x =11 و تعداد کروموزوم، x 22 2n =2= بود بر اساس شاخصهاي مقدار نسبی کروماتین و دیگر شاخصها، مشخص شد که جمعیت زابل داراي متقارن ترین و جمعیت همدان داراي نامتقارن ترین کاریوتیپ بود.
مقدمه
قیچ - Z. fabago - گیاهی علفی از خانواده Zygophyllaceae میباشد که غالباً در نواحی مدیترانهاي یافت میشود. این گیاه در پاکستان، افغانستان، ایران، عراق، سوریه، ترکیه، رومانی، روسیه، عربستان، شمال آفریقا و بخشهایی از اسپانیا و فرانسه پراکندگی دارد . - 6 - قیچ گیاهی چند ساله، به ارتفاع 20 تا 120 سانتی متر میباشد. برگهاي این گیاه مرکب، دو برگچهاي بوده و گلها در طول ساقه به صورت پراکنده قرار دارند.
گلبرگها واژتخم مرغی، تقریباً هم اندازه کاسبرگها و سفید رنگ با قاعده نارنجی هستند. پرچمها بلندتر از گلبرگها بوده و میوه نیز کپسول بدون بال، مستطیلی استوانهاي، به طول 10 تا 40 میلیمتر میباشد. دانههاي این گیاه کوچک بوده ودر هر حجره 5 تا 7 عدد دانه وجود دارد . - 5 - روغن این دانهها با داشتن مقادیر بالایی از اسید هاي چرب ضروري و با توجه به اهمیت این مواد براي انسان، می تواند منبعی جدید، قابل جایگزینی و مهم براي تولید لینولئیک اسید و آراچیدونیک اسید باشد. - 3 -
این گیاه داراي خاصیت ضد سرفه، اکسپکتورانت - خلط آور - ، ضد سوختگی و برطرف کننده درد است . - 4 - از این گیاه براي درمان بیماريهاي مربوط به دستگاه گوارش هم استفاده میشود . - 11 - تا کنون هیچ بررسی کروموزومی بر روي این گیاه در ایران انجام نشده است. سیتوژنتیک با بیوتکنولوژي روابط تنگاتنگی دارد به طور مثال در ریز ازدیادي که براي تکثیر محصولات بیوتکنولوژي بسیار پر کاربرد است مطالعات سیتوژنتیکی می تواند براي تعیین میزان تغییرات سوماکلونی در حین ریزازدیادي به کار رود . - 1 -
برخی از محصولات علوفه اي نظیر یونجه، شبدر و خلر به عتوان محصولات مدل هستند که براي توالی یابی ژنوم با استفاده از ترکیب سیتوژنتیک و تکنیک هاي مولکولی مورد استفاده قرار گرفته اند . - 14 - با توجه به این مطالب انجام مطالعات سیتوژنتیکی براي فنون بیوتکنولوژي می تواند راهگشا باشد. مطالعات کروموزومی مطالعات کاریوتیپی در داخل جمعیتهاي یک گونه داراي اهمیت است. زیرا جمعیتهاي یک گونه سازش ژنومی خاص خود را با محیطی که در آن میرویند، نشان میدهند . - 13 -
درصد شکل کلی یا درصد کل فرم - %TF - جهت مقایسه و بررسی تقارن کاریوتیپ ها، تعیین ارتباط کاریوتیپی بین گونهها و جنسها و به عنوان شاخص دسته بندي کاریوتیپ استفاده شده است . - 9 - این نسبت، همبستگی مثبتی با تقارن کاریوتیپ دارد و از نسبت مجموع طول بازوهاي کوتاه به مجموع طول کل کروموزومها بدست میآید. هر چه میزان %TF به عدد 50 نزدیکتر باشد، نشان دهنده حضور بیشتر کروموزومهاي متاسانتریک نسبت به سایر حالتهاي کروموزومی میباشد.
مقدار نسبی کروماتین - VRC - که از نسبت مجموع طول کروموزومها به تعداد کروموزوم هاپلوئید در کاریوتیپ بدست میآید که بیشتر بودن آن نشان دهنده تکامل کاریوتیپ و نا متقارن تر بودن آن است. SSa مجموع بازو هاي کوتاه در جمعیت است. اختلاف دامنه طول نسبی - DRL - ، این پارامتر نیز توسط هوزیوارا - 1962 - و با استفاده از پارامتر طول نسبی کروموزوم از طریق تفاضل کمترین و بیشترین مقدار طول نسبی کروموزوم محاسبه شده است و به عنوان شاخصی براي وضعیت تقارن به کار میرود. بطوریکه هر چه مقدار این پارامتر در یک گونه یا رقم بیشتر باشد، کاریوتیپ مربوطه نامتقارنتر بوده و آن گونه یا رقم در درجه بالاتري از تکامل کاریوتیپی قرار میگیرد.
جهت نامگذاري انواع کروموزومها از روش لوان - 1964 - استفاده میشود. در این روش با استفاده از مؤلفه نسبت طول بازوي بلند به بازوي کوتاه - r-value - انواع مختلف کروموزومها مشخص و نامگذاري میگردد. مواد و روشها بذر 8 جمعیت مختلف از مناطق زنجان، همدان، مشهد، مازندران، ، سنجان، سمنان، یزد و زابل از طریق بانک ژن تهیه شد.
براي مطالعه کروموزومهاي متافازي سلول هاي مریستمی نوك ریشه، پس از روش رنگ آمیزي آقایف - 1996 - استفاده گردید. به این منظور بذور هر جمعیت، با قارچ کش ویتاواکس دو در هزار به مدت 10 دقیقه ضدعفونی شده و تحت شرایط استریل، داخل پتري دیش و روي کاغذ صافی کشت شدند و دماي دستگاه بر روي25 ± 2 درجه تنظیم شد.
پس از گذشت 2 الی 3 روز ریشه هایی که داراي طول مناسب یعنی 10 الی 15 میلی متر بودند انتخاب شده و براي پیش تیمار، در محلول آلفا برومو نفتالین 0/5 درصد، به مدت 45 دقیقه قرار گرفتند. پس از آن ریشهها شسته شده و با استفاده از کاغذ صافی خشک شدند. از محلول لویستکی به عنوان تثبیت کننده و جلوگیري کننده از کوتاه شدن بیش از حد کروموزومها استفاده شد. مدت زمان لازم براي تثبیت، 36 ساعت در یخچال با دماي 4 درجه سانتیگراد بود. سپس ریشهها به مدت 3 ساعت با آب شهر شستشو شدند.
در مرحله نگهداري، ریشهها به اتانول 70 درصد منتقل و در یخچال با دماي 4 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. در هنگام مطالعه، ریشهها از الکل خارج شده و به مدت 30 دقیقه با آب مقطر شستشو شدند. ریشهها براي هیدرولیز به محلول یک نرمال هیدروکسید سدیم در حمام بخار آب با دماي 60 درجه سانتیگراد و به مدت10 دقیقه انتقال داده شدند و پس از هیدرولیز به مدت یک دقیقه با آب مقطر شستشو داده شده و براي رنگ آمیزي در رنگ استوآهن هماتوکسیلین قرار گرفتند. در پایان از هر نمونه چندین لام تهیه شد و براي عکس برداري از کاریوتیپ نمونههاي مورد مطالعه از سیستم مانیتورینگ استفاده شد.
بطوریکه تصاویر کروموزومی از طریق دوربین ویدئویی Canon که بر روي میکروسکوپ نوري Olympus مدل BX-40 نصب شده بود، به مانیتور منتقل شده و ضبط گردید. براي هرجمعیت پس از تعیین تعداد کروموزوم، کاریوتیپ تهیه و صفاتی از قبیل، طول هر کروموزوم، طول بازوي بلند، طول بازوي کوتاه و نسبت بازوي بلند به کوتاه، طول بزرگترین کروموزوم، طول کوچکترین کروموزوم، مقدار کروماتین نسبی و شاخصهاي مربوط به تقارن کروموزومها اندازه گیري شد.
نتایج و بحث
در بررسیهاي سیتوژنتیکی انجام شده بر روي 8 جمعیت مورد مطالعه، تعداد کروموزوم در تمامی جمعیتها برابر 2n=2x=22 بود. فرمول کاریوتیپی جمعیتها حاکی از آن بود که در جمعیت سمنان تمامی کروموزوم ها متاسانتریک بودند اما در 7 جمعیت دیگر هم کروموزوم هاي متاسانتریک و هم کروموزوم هاي ساب متاسانتریک حضور داشتند. بزرگترین کروموزوم در جمعیت همدان - 2/11 - ، و کوتاهترین کروموزوم در جمعیت زابل - 0/74 - مشاهده شد. بیشترین میانگین طول کل کروموزومها مربوط به جمعیت همدان - 17/83 - و کمترین آن مربوط به زابل - 11/76 - بود.
مقدار نسبی کروماتین در جمعیت همدان - 1/62 - بالاترین مقدار و در جمعیت زابل - - 1/06 کمترین مقدار را به خود اختصاص داد، که این شاخص هر چه بیشتر باشد، نشان دهنده تکامل کاریوتیپ و نامتقارن بودن آن است. بیشترین اختلاف در طول نسبی کروموزومها در جمعیت سنجان - 7/97 - و کمترین آن مربوط به جمعیت زابل - 5/52 - بود. مجموع طول بازوهاي کوتاه - SSa - در جمعیت همدان داراي بالاترین مقدار و در جمعیت زابل کمترین مقدار را به خود اختصاص داد.
