بخشی از مقاله
چکیده
تقاضاي بیشتر براي برنجهاي عطري، قیمت بالاتر آنها را درپی دارد. توجه بهنژادگران به شناسایی عوامل ژنتیکی کنترلکننده عطر جلب شدهاست. استفاده از کروماتوگرافی گازي توأم با طیفسنجی جرمی، روشی مناسب براي ارزیابی ترکیبات عطري میباشد. نشانگرهاي شدیداً پیوسته با ژنهاي مهم زراعی، عمل گزینش را سودمندتر، مؤثرتر، واقعیتر و کم هزینهتر از روشهاي معمول به نژادي مینمایند.
هدف از اجراي این تحقیق نقشهیابی مکانهاي ژنی کنترلکننده ترکیبات فرّار برنج با استفاده از نشانگرهاي ریزماهواره بود. از تلاقی رقم موسیطارم و 304، 139 تک بوته F2 در سال 1386-87 بصورت مجزا بذرگیري و براي کشت مورد استفاده قرار گرفتند. ستون ديبیایکس- 5، جهت جداسازي وشناسایی ترکیبات فرّار نمونههاي بذري مورد استفاده قرار گرفت.
تجزیه QTL با استفاده از نرم افزار کارتوگرافر انجام شد. 113 ترکیب متفاوت شناسایی شدند که ترکیبهاي آلکانی تترادکان، پنتا دکان، هگزادکان و هپتادکان را نیز شامل میشد. کروموزومهاي 1، 4، 6، 11 و 12 حامل جایگاه کنترل کننده ترکیبهاي فرّار بوده و کروموزوم 4 بیشترین جایگاه کنترل کننده را دربر داشت. از 14 جایگاه شناسایی شده، 12 جایگاه حالاتی از غالبیت نسبی، غالبیت کامل و یا فوق غالبیت را نشان دادند. هپتادکان کمترین میزان توارثپذیري و تترادکان بیشتر از % 50 توارثپذیري را نشان داد. فاصله مطلوب بین نشانگر و QTL فاصلهاي کمتر از 4/5 سانتیمورگان پیشنهاد شده است که در این آزمایش چندین جایگاه با چنین ویژگی شناسایی شدهاست.
مقدمه
بعد از عملکرد، کیفیت دانه به عنوان دومین هدف مهم بهنژادي برنج در نظر گرفته میشود. برنجهاي عطري که مدت زمان زیادي است در آسیا عمومیت دارند، در سالهاي اخیر پذیرش گستردهتري پیدا کردهاند. تقاضاي بیشتر براي برنجهاي عطري، قیمت بالاتر آنها را درپی دارد. این وضعیت توجه بهنژادگران برنج را در شناخت عوامل ژنتیکی کنترلکننده عطر برانگیخته است - . - 1
استفاده از کروماتوگرافی گازي1 و یا کروماتوگرافی گازي جفت شده با طیفسنج جرمی - 7 - 2، روشی بسیار مناسب براي سنجش ترکیبات متفاوت نمونه گیاهی از جمله ترکیبات فرّار و عطري میباشد - . - 7 با وجود این، هزینه ارزیابی از این طریق میتواند یک عامل بازدارنده باشد، بخصوص در تعیین مکانهاي ژنی کنترل کننده ترکیبات عطري در نسلهاي در حال تفرق که معمولاً ناچار به ارزیابی تعداد زیادي نمونه میباشد.
استفاده از تکنیک ریزاستخراجی فاز جامد3 براي استخراج ترکیبات آلی از نمونهها، و انتقال مستقیم آنها به محل تزریق دستگاه کروماتوگراف گازي جهت جداسازي مواد از طریق حرارت و تجزیه آنها مورد استفاده قرار می گیرد - . - 7 روش مذکور به دلیل سادگی در انجام، راندمان کار، دقت خوب، و محدودیت کم براي تشخیص و امکان ماشینی کردن تکنیک، به طور فزایندهاي در زمینههاي تجزیه محیطی و مواد غذایی توجهها را به خود جلب کرده است - . - 7
از کاربردهاي اساسی نشانگرهاي DNA در تحقیقات کشاورزي، ایجاد نقشههاي پیوستگی براي گونههاي متفاوت گیاهان زراعی است. این نقشهها براي شناسایی نواحی کروموزومی که دربرگیرنده ژنهاي کنترلکننده صفات ساده و کمی هستند،استفاده می شوند - . - 4 نشانگرهایی که پیوستگی شدیدي با ژنهاي مهم زراعی دارند، ممکن است به عنوان ابزاري براي انتخاب با کمک نشانگر1 در بهنژادي گیاهان زراعی از جمله برنج به طور گستردهاي استفاده شده و به عنوان جایگزینی براي انتخاب فنوتیپ، عمل گزینش را بسیار سودمندتر، مؤثرتر، واقعیتر و کم هزینهتر از روشهاي معمول بهنژادي مینماید - . - 4
نشانگرهاي مبتنی بر واکنش زنجیرهاي پلیمراز2 از قبیل ریزماهوارهها - - 11 نقش معنیداري را در نقشهیابی و گزینش با کمک نشانگرها داشتهاند. گزینش با استفاده از روشهاي سنتی بهبود کیفیت، به دلیل فقدان گروههاي مجزاي فنوتیپی در نتاج و خسته کننده بودن روش هاي آزمون کیفیت، براي بهنژادگران مشکل است. بالارد و هولگوین - - 3 با آزمایش بر برنج به این نتیجه رسیدند که ترکیب خاصی مسئول عطر برنجهاي خام یا نپخته نمیباشد.
اثر سفید کردن بر عطر برنج ارزیابی و مشخصشد که بیشترین ترکیبات فرّار در حالتی دیده میشود که برنج تا %92 سفید شدهباشد و بنابراین لایههاي سطح بیرونی برنج نقش مهمی را در تشکیل طعم عطر ایفا میکنندترکیبات. فرّاري چون لیمونین، پنتادکان، هگزادکان، هپتادکان، دودکان و هگزانول رد برنج پخته شده گزارش شدهاند - . - 12
مطالعه ژنتیک کیفیت برنج، در مجموعههاي ژنوتیپی متفاوتی، با استفاده از نشانگرهاي مولکولی صورت گرفته است - 1 و . - 9 یک ژن مغلوب بزرگاثر کنترل کننده عطر، بر روي کروموزوم 8 برنج عطريآمریکایی به نام دلّا - - 1، رقم بنگلادشی به نام سرجارمخی - - 17 و رقم فیلیپینی به نام آزوسنا - - 9 با استفاده از تکنولوژي آرافالپی و رپید، نقشه یابی شده است.
به نقل از یانجان و همکاران - - 16، صدیق و همکارانش دو ژن مغلوب کنترل کنندة عطر در رقم هندي تی3، بر روي کروموزومهاي 5 و 9 گزارش کردند. براي صفت عطر، ژن fgr نزدیک ناحیه سانترومري کروموزوم 8 تعیین محل شده است - 1 و - 2 که سطح AP3 را تعیین میکند - - 9 و با فاصله 4/5 سانتی مورگان، با نشانگر آرافالپی به نام RG28 کاملاً پیوستگی نشان میدهد.
همچنین دو QTL براي عطر، یکی بر کروموزوم 4 و دیگري بر کروموزوم 12 گزارش شدهاست - . - 6 برادبري و همکاران - - 2، چند شکلی معنیداري براي یک ژن در ناحیه کدکننده ژنوتیپهاي عطري برنج نسبت به انواع بدون عطر با وضعیت مشابهی براي ژن badh2 گزارش کردهاند. ژن badh2 - کد کننده بتائین آلدهاید هیدروژناز - 2، کنترل کننده عطر، بر روي بازوي بلند کروموزوم 8 برنج قرار دارد. این ژن براي غربال ژنوتیپ هاي عطري در نتاج در حال تفرق برنج قابل استفاده است - . - 2 هدف از اجراي این تحقیق شناسایی و نقشهیابی مکانهاي ژنی QTL - هاي - کنترل کنندهترکیبات فرّار و عطري در برنجبا استفاده از نشانگرهاي ریزماهواره بود.
مواد و روشها
از تلاقی بین رقم موسیطارم و 304، 139 تک بوته F2 در سال 1386 به صورت مجزا بذرگیري و براي کشت 139 فامیل F2:3 به همراه والدین در سال 1387 مورد استفاده قرار گرفتند. تهیه خزانه در اردیبهشت ماه 1387 در شرایط گلخانهاي و در ظروف پلاستیکی در دانشگاه شهرکرد صورت گرفت و تا انتقال نشاءها به زمین اصلی - واقع در دشت خانمیرزا در فاصله 35 کیلومتري لردگان - ، مراقبتهاي لازم اعمال گردید. در مرحله پنجهزنی از تمامی بوتههاي موجود براي هر کرت آزمایشی - هر فامیل - نمونههاي برگی گرفته شده و استخراج DNA با استفاده از روش CTAB انجام شد.
کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز %./8 و دستگاه اسپکتروفتومتري صورت گرفت. هشتاد و یک جفت آغازگر بر اساس نقشههاي SSR ارائه شده در آدرس اینترنتی - http://www.gramene.org/microsat/RM_primers - و چهار جفت آغازگر بر اساس گزارشات ارائه شده براي ترکیبات عطري انتخاب گردیدند. فاصله آغازگرهاي انتخاب شده بر روي هر کروموزوم بین 15 تا 20 سانتیمورگان متغیر بود. واکنش زنجیرهاي پلیمراز در میکروتیوبهاي 0/2 میلی لیتري و با حجم واکنش 20 میکرولیتر بر اساس پیشنهاد مککوچ و همکاران - - 11 انجام گرفت.
دستگاه کروماتوگرافی شیمادزو مدل 17آ با ستون نوع ديبیایکس- %95 - 15 فنیل، و %5 پلی داي متیل سیلوکسان - جهت جداسازي و شناسایی ترکیبات فرّار نمونههاي بذري برنج مورد استفاده قرار گرفت. استخراج، جداسازي و شناساییترکیبات فرّار با استفاده از روش غیاثوند و همکاران - 7 - انجام شد. تجزیه QTL با استفاده از نرم افزار کارتوگرافر - 14 - 2 انجام شد. بررسی QTLها با استفاده از روش نقشهیابی فاصلهاي مرکب با سرعت پیمایش 0/5 سانتیمورگان و اندازه پنجره 10 سانتیمورگان و تعداد 5 نشانگر به عنوان کنترل - 3همعامل - صورت گرفت. آستانه معنیداري - LOD - 4 مورد استفاده براي انتخاب QTLها براي تمامی صفات مقدار 3 در نظر گرفته شد.
نتایج و بحث
در این آزمایش 113 ترکیب متفاوت شناسایی شدند که با بررسی ترکیبهاي شناسایی شده با درصد بالایی از شباهت، دیده شد که ترکیبهاي آلکانی تترادکان، پنتادکان، هگزادکان و هپتادکان جزئی از ترکیبهاي شیمیایی موجود در برنج بودند. این ترکیبها توسط دیگر محققین نیز گزارش شده است - 12 و . - 15 نتایج حاصل از تجزیه QTL مربوط به ترکیبهاي شیمیایی در جدول 1 گزارش شده است.
نتایج نشان دادند که کروموزومهاي 1، 4، 6، 11 و 12 حامل جایگاه کنترل کننده ترکیبهاي فرّار مورد بررسی بوده و کروموزوم 4 بیشترین جایگاه کنترل کننده ترکیبهاي مذبور را دربر داشت. گزارشات قبلی تنها از وجود یک ژن کنترل کننده - fgr - یا آغازگرهاي مرتبط با آن بر کروموزوم شماره 8 دلالت داشتند - 1، 5، 6 و. - 9 نکته قابل توجه جایگاههاي کنترل کننده ترکیبها، نحوه عمل جایگاهها با توجه به نسبت غالبیت آنها بود. از 14 جایگاه شناسایی شده، 12 جایگاه داراي حالاتی از غالبیت نسبی، غالبیت کامل و یا فوق غالبیت بودند. بنابراین ترکیبهاي مورد نظر توارثپذیر بوده ولی امکان تثبیت را ندارند.
علت عدم تثبت چنین ترکیبهایی به ماهیت خودگشن بودن گیاه برنج برمیگردد. یکی از دلایل مشاهده اثرات فوق غالبیت ژن صفات کمی، پراکندگی ژنهاي کنترل کننده ویژگیهاي مورد بررسی در والدین مربوط به تلاقی می باشد. با مراجعه به جدول 1 و تکیه بر سهم واریانس توجیهی توسط جایگاههاي کنترل کننده، دیده شد که هپتادکان داراي کمترین میزان توارثپذیري شناسایی شده - مجموع سهم واریانس جایگاههاي کنترل کننده هپتادکان - بود. ترکیب تترادکان بیشتر از % 50 توارثپذیري داشت. جایگاههاي داراي عمل افزایشی، نشان از توارثپذیري و قابلیت تثبیت آن جایگاهها میباشد.
