بخشی از مقاله
چکیده فارسی
در این پزوهش از نشانگر AFLP براي شناسایی دورگه هاي بستر و ارزیابی ژنتیکی آنها استفاده گردید. شناسایی دورگه هاي بستر با استفاده از مقایسه الگوي باندي الکتروفورز آنها و گونه هاي والد انجام گردید. ظهور همزمان باندهاي تشخیصی ثابت گونه هاي والد در هیبریدها، آنالیز هاي فاصله و شباهت ژنتیکی و ترسیم دندوگرام UPGMA شناسایی دقیق هیبریدها را امکانپذیر ساخت. به این منظور از8 جفت ترکیب آغازگرهاي - Mse+4, Eco+3 - استفاده گردید که در مجموع 250 باند قابل امتیازدهی در محدوده 40 الی 1000 جفت باز ایجاد گردید. ترکیب آغازگرهاي - E-AAG, M-CGAT - و - E-AAT, M-CGAT - باندهاي تشخیصی هیبریدها و گونه هاي والد را ایجاد کردند. همچنین نتایج حاصل از شباهت ژنتیکی نشان داد که بستر شباهت بیشتري به فیل ماهی - 0/68 - در مقایسه با استرلیاد - 0/45 - دارد. نتایج بدست آمده ثابت می کند که این روش براي شناسایی دقیق گونه ها و هیبریدهاي بین جنسی نظیر بستر بسیار مناسب است.
لغات کلیدي: AFLP ، شناسایی هیبرید، بستر
مقدمه
نیاز بالاي تجاري به تاسماهیان و وضعیت در حال انقراض آنها، همچنین بعلت وقوع هیبریدهاي درون گونه اي، بین گونه اي و بین جنسی در طبیعت و در آبزي پروري، بنظر می رسد که وجود تکنیک هاي دقیق جهت شناسایی هیبریدها در محصولات فرآوري شده، تجاري و نمونه هاي زنده جهت تضمین برنامه هاي بازسازي ذخایر ضروري باشد . - 4 - هیبرید بستر - Huso huso × A. ruthenus - به دلیل دارا بودن میزان رشد بالاتر نسبت به والد نر و نیز رسیدگی جنسی سریعتر نسبت به والد ماده خود، یک گونه با ارزش تجاري جهت آبزي پروري محسوب می گردد
. - 2 - نشانگر AFLP که قابلیت شناسایی تعداد بالایی از مارکرهاي ژنومی غالب را دارا می باشد از انواع نشانگرهاي مبتنی بر PCR است که ترکیبی از RFLP و RAPD بوده، شامل هضم DNA ژنومی با آنزیم هاي برشی خاص و اتصال رابط هاي چند نوکلئوتیدي کوتاه به انتهاي قطعات برش یافته و سپس تکثیر قطعات - PCR - می باشد .
- 7 - از آنجاییکه تولید دورگه ها در تاسماهیان در آبزي پروري متداول می باشد، استفاده از مارکرهاي مولکولی جهت شناسایی هیبریدها و در نتیجه کنترل محصولات تجاري - تا گوشت و خاویار - تا سماهیان بسیار دارد. تکنیک AFLPبه دلیل حساسیت بسیار زیاد در آشکارسازي چندشکلی در سراسر ژنوم و به علت قابلیت تکرارپذیري بالا برRAPD ارجحیت دارد. همچنین بدلیل عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ژنوم مورد مطالعه و نیز سرعت و درجه اطمینان بالا، این روش امروزه بطور وسیعی کاربرد دارد - . - 2 هدف از این پژوهش، بررسی کاربرد نشانگر AFLPبمنظور یافتن نشانگرهایی است که قادر به تشخیص گونه هاي والدین و هیبریدها باشند.
مواد و روشها
در این مطالعه از 12 نمونه شامل 3 گونه - یک عدد مولد استرلیاد نر A. ruthenus، یک عدد مولد فیلماهی ماده H.huso، 5 عدد نتاج گروه کنترل فیل ماهی و 5 عدد هیبرید بستر - H. huso × A. ruthenus - جهت اثبات کاربرد نشانگر AFLP بمنظور شناسایی هیبریدهاي بستر استفاده گردید. پس از اسپرم گیري از مولدین نر استرلیاد وارداتی مجارستان، اقدام به انجام آزمایش لقاح با تخمک فیلماهی ماده شد. بچه ماهیان تولید شده پس از طی یک دوره سازگاري با غذاي کنسانتره %40 - پروتئین %13 + چربی - مورد تغذیه قرار گرفتند. جهت استخراج DNA ژنومی از قسمت کوچکی از باله دمی با استفاده از روش فنل – کلروفرم و بمنظور تعیین کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج شده از ژل آگارز %1 از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده گردید. تکنیک AFLP بر اساس روش Vos وهمکاران - 1995 - با اندکی تغییرات صورت گرفت.
250 نانوگرم از DNA ژنومی با 5 U از آنزیم هاي محدودالاثرECORI و - Fermentas, France - MseI به مدت 90 دقیقه در دماي 37Ċ هضم گردید و آداپتورهاي ECORIو MseI - با غلظت - 50mM به همراه آنزیم الحاق دهنده T4 DNA Ligase و بافر الحاق به مدت 3 ساعت در دماي 37Ċ به انتهاي قطعات برش یافته متصل شدند. تکثیر قطعات متصل شده به آداپتورها طی دو مرحله انجام گرفت. ابتدا نمونه هاي مرحله قبل به نسبت 5:1 رقیق و با آغازگرهاي تک نوکلئوتیدي انتخابی در انتهايَ3ECORI+A - و - MseI+C مورد تکثیر پیش انتخابی قرار گرفتند. محصولات حاصل مجدداً به نسبت 10:1 رقیق و با استفاده از 8 جفت آغازگر شامل ترکیب پرایمرهاي Mse+4 و ECO+3 تحت چرخه هاي حرارتی Touchdownمورد تکثیر قرار گرفتند.
الکتروفورز محصولات PCR با استفاده از ژل پلی آکریل آمید واسرشت - %6 دستگاه الکتروفورز سکانسر مدل SequiGen- 38×30 ، - BIO-RAD و رنگ آمیزي به روش نیترات نقره استفاده شد و الگوي باندي بدست آمده توسط دستگاه اسکنر - مدل - Canon ثبت گردید.جهت تجزیه و تحلیل اطلاعات DNA ،امتیاز دهی باندها بصورت وجود - 1 - و عدم وجود - 0 - صورت گرفت. باندهاي مبهم و از دست رفته نیز بصورت علامت - X - مشخص گردیدند. داده ها بصورت چشمی ثبت گردیده، پس از ورود به نرم افزار Excel جهت تجزیه و تحلیل اطلاعات از نرم افزار Gene Alex استفاده گردید. ماتریس فاصله ژنتیکی Nei و شباهت ژنتیکی بین گونه ها محاسبه گردید و تجزیه خوشه اي با روش UPGMA با استفاده از نرم افزار NTSYS انجام شد.
نتایج و بحث
محاسبات آماري 12 نمونه شامل 3 گونه فیل ماهی، استرلیاد و هیبرید بستر با استفاده از 8 جفت آغازگر؛ مجموعا250 باند قابل امتیازدهی ایجاد کرد که اندازه آنها در محدوده 40 bp و 1000 bp بود. در این بین 69 باند چند شکلی نشان دادند، که از این تعداد 7 باند فقط در یک فرد وجود داشت و بعنوان مارکر تشخیص گونه اي در نظر گرفته شد. میانگین تعداد باندهاي تکثیر شده به ازاي هر جفت آغازگر 31/25 و میانگین تعداد باندهاي چند شکل براي هر آغازگر 8/5 بود. در این میان، ترکیب آغازگر - E-AAT , M -CGAT - داراي بیشترین تعداد باند چندشکل14 - باند - و ترکیب آغازگر - E-AAT , M -CACA - داراي کمترین تعداد باند چند شکل 5 - عدد - بودند.
همچنین ترکیب آغازگر - E-AAG , M-CACA - هیچ باندي تولید نکرد. ترکیب آغازگرهاي - E-AAG, M-CGAT - و - E-AAT, M-CGAT - باندهاي تشخیصی هیبریدها و گونه هاي والد را ایجاد کردند - شکل. - 1 فاصله ژنتیکی جفت نمونه ها بین 0/37 تا 0/83 متغییر بود. فاصله ژنتیکی Nei بین استرلیاد و فیل ماهی بیشترین مقدار - 0/83 - است زیرا دو گونه متفاوت بودند و بر همین اساس هیبرید بستر کمترین اختلاف را با فیل ماهی - 0/37 - و اختلاف بیشتري را با استرلیاد - 0/79 - دارا بود. همچنین نتایج حاصل از شباهت ژنتیکی نشان داد که بستر شباهت بیشتري به فیل ماهی - 0/68 - در مقایسه با استرلیاد - 0/45 - دارد.
دندوگرام ترسیم شده با استفاده از روش UPGMA براي تک تک نمونه ها در مقایسه با هم نشان داد که کلاستر فیل ماهیان - فیل ماهی والد و گروه شاهد - با هیبرید بستر بصورت کلاستر خواهري بودند و استرلیاد یک کلاستر جدایی از فیل ماهی و بستر بود - شکل. - 2 اطلاعات مورفولوژیک جهت اثبات اینکه یک نمونه خاص، هیبرید می باشد کافی نمی باشد و فقط مطالعات ژنتیکی می تواند وجود ژنوم گونه هاي والد در دورگه ها را اثبات نماید . - 3 - در این تحقیق مشخص گردید که نشانگرAFLP در نمونه هاي تاسماهیان بسیار قابل اطمینان و تکرار پذیر می باشد. الگوي باندهايAFLP، تنوع گونه اي مربوطه را نشان داد، بعلاوه بنظر می رسد که با ندهاي مشترك در بین گونه هاي متفاوت کمتر از مقدار آنها در داخل گونه باشد که در نتیجه شناسایی نمونه هایی با منشاء نا مشخص را امکانپذیر می سازد.
اگرچه گونه هاي A.ruthenus و H. huso از لحاظ مورفولوژي قابل تشخیص می باشند ولی در بسیاري از موارد در مراحل پایین رشدي هیبرید بستر و فیل ماهی خیلی شبیه به هم می باشند . - 1 - از آنجاییکه نشانگر AFLP آنالیز تصادفی کلDNA ژنومی را امکانپذیر می سازد، مارکرهاي تشخیصی را می توان به سادگی با اضافه کردن بازهاي انتخابی متفاوت، پیدا نمود - Congiu . - 2 و همکاران - 2002 - با استفاده از نشانگر AFLP، مارکر تشخیص گونه اي براي گونه هاي طبیعی A. naccarii، A. baerii و A.transmontanus و نیز نمونه هاي تجاري گوشت و خاویار 10گونه از تاسماهیان و هیبریدهاي بین گونه اي A. naccarii × A. baerii را شناسایی نمود. نتایج حاصل از این تحقیق در مورد دورگه هاي بستر با نتایج حاصل از تحقیق فوق هماهنگ بود. همچنین نتایج حاصل از آنالیز ژنتیکی نمونه ها نشان داد که هیبرید بستر از لحاظ ژنتیکی شباهت بیشتري به والد ماده یا فیلماهی دارد که با نتایج مطالعات انجام شده روي خصوصیات مورفولوژیکی و داده هاي حاصل از رشد هیبریدهاي بستر منطبق می باشد - . - 1
تشکر و قدردانی
از کلیه همکاران بویژه پرسنل بخش ژنتیک و تکثیر و پرورش انستیتو که در تهیه نمونه و مراحل مختلف آزمون ما رایاري نمودند سپاسگزاري می گردد.
منابع
-1 برادران نویري، ش - 1380 - پرورش تاسماهیان. انتشارات حق شناس. رشت. 115 صفحه.
