بخشی از مقاله
چکیده
هدف از این مطالعه بررسی چند شکلی در ژن گیرنده هورمون محرك فولیکولی - FSHR - در گوسفندان نژاد ایران بلک و بلوچی بوده است. براي این منظور نمونه هاي خون 100 راس گوسفند از دو نژاد ایران بلک و بلوچی واقع در ایستگاه عباس آباد مشهد جمع آوري و با حفظ زنجیره سرد به آزمایشگاه منتقل شد. دي ان اي هر یک از نمونه ها به روش نمکی بهینه یافته استخراج و سپس با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی قطعه اي از این جایگاه ژنی به طول 304 جفت باز به کمک واکنش زنجیره اي پلی مراز - PCR - تکثیر شد. ردیابی چند شکلیها با استفاده از آنزیم MSCӀ و الکتروفورز محصولات حاصل از هضم آنزیمی با رنگ آمیزي اتیدیوم بروماید روي ژل آگارز انجام شد. دو آلل A و B با فراوانیهاي 37/5 و 62/5 درصد در نژاد ایران بلک و 48 و 52 درصد در نژاد بلوچی، مشاهده شد. فراوانی هر یک از ژنوتیپ هاي AB، AA و BB در نژاد ایران بلک به ترتیب برابر با 8/3، 58/3 و 33/4 درصد و در نژاد بلوچی به ترتیب برابر با 26، 44 و 30 درصد برآورد شد. اثر هر یک از ژنوتیپ ها روي صفات تولیدي و تولید مثلی در دست بررسی است.
کلید واژه: FSHR, PCR-RFLP، گوسفند بلوچی،ایران بلک
مقدمه
عقیده بر این است که فعالیتهاي تولید مثلی در گوسفند تحت تاثیر تعداد زیادي ژن قرار دارد اما در این میان هورمون محرك فولیکول - FSH - یکی از هورمون اصلی در فرایند تولید مثل است که در رشد و بلوغ سلول هاي جنسی طی گامه باروري لازم است . - 7 - هورمون محرك فولیکول که با اتصال به گیرندههاي ویژهاي منحصرا در گنادها قرار میگیرد - 8 - ، نقش مهمی در تنظیم عملکرد تخمدان پستانداران ایفا می نماید. گیرنده هورمون محرك فولیکول - FSHR - متعلق به خانواده پپتیدهاي پروتئین جی هفت - G7 - می باشد که توسط سلولهاي گرانولوزا بیان میشود . - 6 - اولین توالی DNA ژن FSHR در سال 1989 توسط گروه واسارز در حالی که ژن TSH انسانی را کلون می کردند کشف شد. گیرنده ژن FSH در انسان روي کروموزم شماره 21 و در گوسفند و خوك روي کروموزم شماره 3 نقشه یابی شد . - 5 -
آنالیز توالی روي ژن گیرنده هورمون محرك فولیکول گاومیش هندي، نشان داد که cDNA ژن FSHR گاو میش، شامل توالی 2085 جفت بازي است که یک پروتیین 695 آمینو اسیدي را کد می کند و توالی نوکلئوتیدي آن بیش از 80 درصد با ژن همولوگ سایر گونههاي پستاندارن شباهت دارد . - 6 - اثر چند شکلی نشانگرهاي RFLP از جایگاه ژنی LHR و FSHR بر احتمال آبستنی در اولین جفت گیري و نیز بلوغ زودرس جنسی مورد مطالعه قرار گرفت که نتایج، اثر این جایگاه ها را در گوساله هاي ماده را توجیه نکرد . - 10 - اما مطالعات پژوهشگران روي گاو ، گوسفند و خوك ثابت کرد که چند شکلی ژن FSHR عملکردتولید مثلی را تحت تاثیر قرار میدهد. این گزارشها بیان کردند که میتوان از این ژن به عنوان یک نشانگر براي افزایش نرخ زایش در حیوانات استفاد کرد . - 3 -
مواد و روش ها
در این پژوهش، از 100 رأس میش نژاد ایرانبلک و بلوچی متعلق به مرکز اصلاح نژاد دام شمال شرق کشور واقع در عباس آباد مشهد خونگیري به عمل آمد. استخراج DNA از روش نمکی بهینه یافته و به منظور بررسی چند شکلی ژن FSHR از تکنیک PCR-RFLP استفاده شد. یک قطعه به اندازه 304 جفت باز با استفاده از یک جفت آغاز گر اختصاصی تکثیر شد. واکنش زنجیره اي پلی مراز در حجم 18 میکرولیتر، شامل ترکیبات با غلظتهاي، 7 میکرولیتر آب استریل دو بار تقطیر، 8 میکرولیتر محلول MASTER KIT شرکت سیناژن، 0/5 میکرولیتر از هر یک از آغازگرها، 2 میکرولیتر DNA انجام شد. چرخه حرارتی شامل 5 دقیقه واسرشت سازي اولیه در دماي 95 درجه سانتی گراد، 35 سیکل واسرشت سازي در 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در 49/5 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، بسط در 72 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه و بسط نهایی به مدت 10 دقیقه بوده است.
پرایمر مورد استفاده دراین پژوهش براي جایگاهژن FSHR شامل یک آغازگر رفت با توالیF: CCCATCTTTGGCATCAG و یک آغازگر برگشت با توالی R: ACACAGTGATGAGGGGCAC بود - . - 2 بعد از تکثیر از الکتروفورز ژل آگارز 1/5 درصد و رنگ آمیزي اتیدیوم برماید براي رویت سازي باندها استفاده شد. براي شنایایی چند شکلیهاي موجود، محصولات PCR تحت تیمار هضم آنزیمی MSCӀ با ترکیباتی شامل 0/2 میکرولیتر آنزیم، 1 میکرو لیتر بافر، 6/8 میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر و 7 میکرو لیتر محصول PCR در دماي 37 درجه به مدت 12 ساعت قرار گرفتند. نمونه ها بعد از تیمار آنزیمی، روي ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز برده و از رنگ آمیزي اتیدیوم بروماید براي رویت سازي باندها و تعیین ژنوتیپ استفاده شد.
نتایج
مشاهده باندها با استفاده از سایز مارکر نشان داد که قطعه 304 جفت بازي FSHR به طور اختصاصی تکثیر شده است. تیمار هضم آنزیمی محصولات به دست آمده در شکل 1 نشان داده شد. همان طوري که در شکل دیده می شود در اثر برش آنزیمی در هر دو نژاد سه نوع ژنوتیپ AA, AB و BB مشاهده شد.ژنوتیپ هر یک از نمونه ها با رویت مستقیم باندها از روي ژل انجام گرفت. فراوانی ژنی و ژنوتیپی در جدول 1 ارایه شد.
بحث
لی و همکاران - 2010 - با مطالعاتی که روي ژن FSHR در بز هایمن چینی با استفاده از تکنیک PCR-SCCP انجام دادند هیچ نوع چند شکلی را ردیابی نکردند . - 3 - یان و همکاران - 2007 - نیز با بررسی ناحیه کناري5 ̒ ژن گیرنده هورمون محرك فولیکولی در بز بوئر، گانژونگ و زینونگ ساننگ، با به کارگیري تکنیک PCR-RFLP هیچ چند شکلی مشاهده نکردند . - 10 - هم چنین لان و همکاران - - 2006 با بررسی اگزون 10 ژن FSHR در بزهاي سفید شانان، انگورا و بوئر هیچ نوع پلی مورفیسمی را پیدا نکردند . - 4 - نتایج بررسیهاي انجام شده با نتیجه آزمایشات ما در این پژوهش مغایرت داشت. پژوهش انجام شده - 2010 - در گاو هلشتاین چینی در ارتباط با رابطه فرا تخمک ریزي و پلی مورفیسم ژن FSHR نشان داد که یک چند شکلی تک نکلئوتیدي G-278A واقع شده در ناحیه بالا دست ژن FSHR گاو سبب تولید سه نوع ژنوتیپ CC، CD وDD شد که گاوهاي داراي ژنوتیپ CC تعداد تخمک و تعداد جنین قابل انتقال بیشتري را نسبت به دو ژنوتیپ CD و DD تولید کردند. نتیجه به دست آمده در آزمایش این محققین در گاو بر این مطلب دلالت دارد که جایگاه FSHR احتمالا می تواند به عنوان مارکر مناسب براي تخمک ریزي زیاد
