بخشی از مقاله
چکیده
لپتوسپیروز یکی از بیماریهاي اسپیروکتی حاد می باشد که به لحاظ گسترش جهانی اهمیت ویژه اي دارد، همچنین به عنوان یکبیماري مشترك در سراسر جهان مطرح است. سرووارهاي درگیرکننده جمعیت هاي گاوي در سراسر جهان معمولاً شامل ایکتروهموراژیه، هارجو، پومونا و گریپوتیفوزا می باشند. هدف از این مطالعه، ردیابی و شناسایی لپتوسپیرا با استفاده از روشهاي Nested PCR و کشت میکروبی ادرار در گاوهاي شیریاطراف تهران در طی سالهاي 1390–91 می باشد.در این مدت تعداد 94 نمونه ادراراز گله هاي مورد مطالعه اخذ گردید و با استفاده از کشت میکروبی و جداسازي باکتري - Culture - methods و واکنش Nested PCR مورد بررسی قرار گرفتند. باکتري مورد نظر از کشت ادرار11 رأس گاوجداسازي شد. همچنین با استفاده از روش Nested PCR، موفق به ردیابی باکتري تا رقت10 عدد در هر میلی لیتر ادرار در 59 نمونه ادرار شدیم.
ضریب توافق کاپا بین دو روش آزمایش -0/03 محاسبه شد که نشان میدهد هیچ همخوانی بین این دو روش آزمایش وجود ندارد - . - p=0/55 همچنین حساسیت و ویژگی روش Nested PCR در مقایسه با روش کشت به ترتیب %54/5 و %36/1 به دست آمد که نشان می دهد Nested PCR از حساسیت بالاتري نسبت به روش کشت - %10/2 - برخوردار است.بنابراین در این مطالعه روش کشت در مقایسه با روش Nested PCR جهت تعیین وضعیت لپتوسپیروري در گاو، به عنوان روش تشخیصی مناسب و حساس ارزیابی نگردید. اما باید به این نکته اشاره نمود که علیرغم پایین بودن حساسیت روش کشت در تشخیص لپتوسپیروز، جداسازي حتی یک مورد لپتوسپیرا از کشت نمونه ادرار می تواند از اهمیت بالایی برخوردار باشدزیرا این جدایه در مراحل بعدي می تواند جهت تایپینگ و تعیین سروتیپ بیماریزا در منطقه مورد ارزیابی قرار گیرد.
واژه هاي کلیدي: لپتوسپیروز، لپتوسپیرا، گاو، کشت میکروبی، .Nested PCR
مقدمه و هدف
لپتوسپیروزیکی از بیماریهاي عفونی مهم مشترك بین انسان و دام با گسترش جهانی است که طیف وسیعی از پستانداران از قبیل گاو، گوسفند، بز، شتر، نشخوارکنندگان وحشی، اسب، سگ، جوندگان و انسان را درگیر می کند. این بیماري در تمام نقاط جهان به جز قطب جنوب وجود دارد . - 3 - لپتوسپیروز علاوه بر اهمیت بهداشتی، از جنبه اقتصادي نیز بسیار حائز اهمیت استکه منجر به ایجاد سقط، مرده زایی، ناباروري، کاهش تولید شیر و مرگ و میر دامها در صنعت دامپروري می شود. البته هزینههاي سنگین ناشی از پیشگیري، کنترل و درمان بیماري را هرگز نباید از یاد برد . - 4 - عامل بیماري، باکتري لپتوسپیرا می باشد که متعلق به خانواده لپتوسپیراسه و در راسته اسپیروکتال قرار دارد. تماس با مایعات بیولوژیکی آلوده به این باکتري، در انتقال بیماري نقش دارد، اما از این میان ادرار آلوده به عنوان مهمترین منبع شناخته شده است، چرا که جرم قادر است براي مدتهاي طولانی در توبول هاي کلیوي باقی مانده و براي ماهها یا حتی سالها از طریق ادراردفع گردد . - 6 -
مطالعات انجام شده در ایران حاکی از آن است که پراکندگی وسیع سروتیپ هاي مختلف باکتري لپتوسپیرا در نقاط مختلف کشور وجود دارد.از آنجا که لپتوسپیروز یک بیماري هزار چهره محسوب می گرددو علایم بالینی این بیماري آنقدر اختصاصی نیست که بتوان بدون در نظر گرفتن نتایج آزمایشگاهی تشخیص قطعی داد،لذا بکارگیري روشهاي مختلف آزمایشگاهی، ابزار بسیار مهمی در تشخیص قطعی بیماري می باشد. پیشرفت هاي اخیر که در زمینه روشهاي مولکولی صورت گرفته، راههاي جدیدي را براي تشخیص سریع و اختصاصی لپتوسپیراها فراهم نموده است. از جمله مهمترین این روشها، آزمایش واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - است که در تشخیص سریع بیماریهاي عفونی به خصوص بیماریهاي ناشی از میکروارگانیسم هاي کند رشدو سخت رشد به کار می رود.
آزمایش PCR در نشاندادن آنتی ژن لپتوسپیرا از اولین روزهاي ابتلاء تا پایان مرحله لپتوسپیروریا در مراکز مختلف تحقیقاتی با نتایج مختلف امارضایت بخشی همراه بوده است ولی در ایران به دلیل مشکلاتی که در امر استاندارد نمودن آن وجود داشته - به ویژه در نمونه هاي بالینی خون و ادرار - هنوز به صورت روتین مورد استفاده قرارنگرفته است. براي این منظور در تحقیق حاضر از روشآزمایشگاهی کشت ادرار در محیط اختصاصیGRA-SINA و روشNested PCR استفاده گردید.نتایج این بررسی می تواند در جهت ارائه تعریف دقیقتري از سیماي بالینی لپتوسپیروز در استان تهران مورد استفاده قرار گیرد و نیز کمک مؤثري در جهت شناخت دقیق تر وضعیت فعلی لپتوسپیروز در جمعیت گاوهاي منطقه باشدو نهایتاً موجب تسریع در امر تشخیص بیماري و اتخاذ اقدامات بعدییعنیکنترل، پیشگیري و درمان این بیماري عفونی و مشترك انسان و دام خواهدبود.
مواد و روش ها روش جمع آوري نمونه ادرار:در مطالعه حاضر، از بهمن ماه سال 1390 لغایت اردیبهشت ماه سال 1391 با مراجعه به دامپروریهاي مورد مطالعه، از 94 رأس دام مشکوك - که از نظر سرولوژیک مثبت یامنفی بودند - با روش ماساژ، اقدام به اخذ نمونه ادرار و جمع آوري آن در ظروف شیشه اي تیره رنگ مخصوص استریل شده، گردید.لازم به ذکر است که نمونه ها از قسمت میانی جریان ادرار تهیه شد تا آلودگی هاي ثانویه آن به حداقل برسد.ادرار جمع آوري شده بلافاصله به دو لوله آزمایش استریل که یکی فاقد فرمالین و دیگري حاوي 0/1 تا 0/5 درصد فرمالین خالص فیلتر شده - از فیلتر 0/22 نانومتري - بود، منتقل شده و در محل تاریک قرار گرفتند.
با استفاده از نمونه ادراري که به آن فرمالین اضافه نشده بود، کشت باکتري در کوتاهترین زمان ممکن و در همان محل دامپروري در یک اتاق نسبتاً تمیز و در کنار شعله با وسایلی که از قبل استریل شده بود، صورت گرفته و سپس بقیه نمونه ها جهت آزمایش مستقیم میکروسکوپی و سایر آزمایشات مولکولی در کنار یخ به آزمایشگاه منتقل شدند.لازم به یادآوري است که کلیه آزمایشات سرولوژیک، باکتریولوژیک و مولکولی مربوط به نمونه هاي اخذ شده در آزمایشگاه تحقیقاتی لپتوسپیروز واقع در بیمارستان آموزشی، پژوهشی شماره یک دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران به انجام رسیده است.روش کشت و جداسازي باکتري:ابتدا با استفاده از پیپت پاستور استریل در کنار شعله، از ظرف نمونه ادرار بدون فرمالین، مقدار بسیار کمی نمونه ادرار برداشت شده، سپس درب لوله حاوي محیط کشت GRA-SINA در شرایط استریل و در کنار شعله باز شده و نمونه به داخل لوله منتقل می شد.
لازم به ذکر است زیاد بودن حجم نمونه تلقیح شده باعث افزایش آلودگی و محدودیت رشد لپتوسپیراها می شود. عمل تخلیه نمونه بایستی از قسمت انتهایی لوله به سمت سطح محیط کشت صورت گیرد. سپس درب لوله فوراً بسته شده و در محیطی تاریک به آزمایشگاه منتقل می شد. نکته قابل توجه این است که لوله ها حتی الامکان باید در دماي نزدیک به 30 درجه سانتیگراد و به صورت عمودي حمل شوند. محیط هاي کشت در آزمایشگاه بلافاصله در گرمخانه 30 درجه سانتیگراد قرار داده شده و پس از گذشت 2 هفته، به صورت هفتگی و به مدت 2 ماه با استفادهاز میکروسکوپ زمینه تاریک مورد بررسی قرار گرفتند.
در صورت مشاهده رشد باکتري در محیط کشت، فوراً کشت فرعی از محیط مورد نظر در یک محیط کشت جدید انجام می گرفت تا شرایط براي رشد باکتري لپتوسپیرا مساعدتر گردد - . - 7 آزمایشPCR و:Nested PCR این روش آزمایش مطابق روش گریتسن و همکاران، با اندکی تغییرات در آزمایشگاه تحقیقاتی لپتوسپیروز، انجام شد - . - 5 در مطالعه حاضر از دو جفت پرایمراستفاده گردید و براي استخراج DNAنمونه ها، از کیت استخراج DNA آکوپرپ - Accuprep Genomic - DNAExtraction Kit ساخت شرکت Bioneer استفاده شد.برنامه آزمایشPCR و Nested PCR جهت تشخیص حضور لپتوسپیراها در ادرار جمع آوري شده از گاوهاي تحت مطالعه به شرح ذیل بود:
نتایج
نتایج حاصله از کشت 94 نمونه ادرار تهیه شده از دامهاي مورد مطالعه، حاکی از مثبت بودن 11 نمونه اخذ شده بود. همچنین با استفاده از روش Nested PCR قادر به ردیابی و شناسایی DNA لپتوسپیرا در 59 نمونه ادرار اخذ شده - که جمعیت میکروبی در هر میلی لیتر ادرار تا 10 باکتري بود - از مجموع نمونه هاي مورد نظر شدیم. ضریب توافق کاپا بین دو روش آزمایش -0/03 محاسبه شد. همچنین حساسیت و ویژگی روش Nested PCR به ترتیب %54/5 و %36/1 و روش کشت %10/2 و %85/7به دست آمد.ضمناً ارزش اخباري مثبت و منفی روش Nested PCR به ترتیب %10/2 و %85/7 وروشکشت %54/5و%36/1به دستآمد.
بحث
با توجه به اینکه سخایی - 1 - موفق به ردیابی تعداد بیشتر از 2000 عدد باکتري در هر میلی لیتر ادرار شدهو از طرفدیگر عبداله پور - 2 - موفق به ردیابی تعداد کمتر از 10عدد باکتري در هر میلی لیتر ادرار شده که با نتایج تحقیق حاضر کاملاً همخوانی دارد، محققین معتقدند که فاکتورهاي مهارکننده متعددي از قبیل: هموگلوبین، نمکهاي صفراوي، پلی ساکاریدها،
