بخشی از مقاله
چکیده
هدف از تحقیق حاضر شناسایی مورفولوژیک و بررسی مولکولی جلبک قهوهای غالب در ساحل اولی بوشهر با استفاده از کلید های شناسایی معتبر و توالی ITS2 و ارزیابی محتوای اسیدهای چرب آنها بود. به این منظور نمونهبرداری از سواحل اوولی در زمستان 1395 انجام شد. شناسایی مورفولوژیک با استفاده از کلیدهای معتبر شناسایی گونههای سارگاسوم و مشاهدات میکروسکوپی انجام شد. در بررسی مولکولی ابتدا ژنوم جلبکها با روش CTAB تغییر یافته استخراج و سپس با استفاده از آغازگر ITS2 و PCR قطعات ژنومی تکثیر یافت.
آنالیز توالی نمونههای جلبکهای قهوهای مورد بررسی، توسط نرمافزارهای Chromas pro، BioEdit و MEGA7 انجام شد . استخراج اسیدچرب با استفاده از روش استاندارد و کروماتوگرافی گازی GC انجام گرفت. نتایج شناسایی مورفولوژیک و مولکولی گونه جلبک قهوهای Sargassum muticum را با اطمینان %100 مورد تایید قرار داد. نتایج Blast در NCBI نشان داد گونهی Sargassum muticum شباهت 100 درصدی به گونه ی همسان دریای چین دارد.
15 اسید چرب از گونهی Sargassum muticum استخراج شد. در چربی کل جلبک قهوهای Sargassum muticum، عمده ترین اسید چرب به ترتیب اولئیک اسید و کم ترین اسید چرب مریستیک اسید بودند. نتایج تحقیق حاضر بیانگر آن است که ضمن حفظ تنوع زیستی جلبکهای قهوهای گونه Sargassum muticum در زیستگاه طبیعی آنها - ساحل اوولی - ، میتوان با بهرهبرداری بهینه و پایدار، از این منابع ارزشمند دریایی بهعنوان مواد اولیه در صنایع دارویی، غذایی و کشاورزی استفاده کرد.
مقدمه
جلبکهای قهوهای به طور گستردهای در نواحی ساحلی، بین جزرومدی و زیر جزرومدی آبهای نواحی گرمسیری یافت می-شوند. این جلبکها در رده Phaeophyceae قرار دارند و شامل 265 جنس و حدود 1500-2000 گونه و تقریبا به طور انحصاری دریایی هستند. تنها 5 یا 6 جنس و گونه از جلبکهای قهوهای متعلق به آب شیرین هستند - Bold and Wynne, . - 1985; van den Hoek et al ., 1995
جلبکهای قهوهای بزرگترین و پیچیدهترین ماکروجلبکها محسوب میشوند و بر اساس دستهبندی Wynne و - 1985 - Bold شامل 13 راسته هستند. تنها سه دسته به نامهای Laminariales, Fucales و Dictyotales به دلیل حضور ترکیبات آنها به طور گسترده بررسی شدهاند . - Gupta and Abu-Ghannam., 2011 - این جلبکها معمولا در مناطق سرد و معتدل جهان پراکنش گستردهای دارند هر چند بسیاری از گونههای سارگاسوم در آبهای گرمتر رشد میکنند . - mark et al., 2011 -
بدلیل وجود شباهتهای مورفولوژیکی بسیار زیاد در بین گونههای جلبک قهوهای و بخصوص گونههای سارگاسوم، در دهههای اخیر، استفاده از اطلاعات ژنتیکی بهعنوان ابزارهای مولکولی در شناسایی این گونه جلبکها و بررسی روابط فیلوژنتیکی، فیلوجغرافی و سیستماتیک آنها، باعث غنیتر شدن کتابخانه ژنی جلبکهای دریایی شده است . - Manoylov, 2014 - بنابراین، کاربرد روش های مولکولی می تواند تا حدود زیادی ابهامات تاکسونومیکی را برطرف نماید. امروزه از ناحیه ژنومی ITS2 بمنظور بررسی روابط فیلوژنتیکی وسیستماتیک مولکولی گونه های جلبک قهوه ای بطور گسترده ای استفاده می شود . - Buchhem, et al., 2011 -
جلبکهای قهوهای منبع خوب اسیدهای چرب و مواد معدنی میباشند . - Chandini et al., 2008 - چربی این جلبکها به دلیل خواص درمانی متعدد، امروزه اهمیت بسیار زیادی در پزشکی و داروسازی دارد. جلبکهای قهوهای از امگا 3 اسیدهای چرب اشباع نشده و فوکوزانتین غنی هستند. اسیدهای چرب همچنین نقشی کلیدی در سوخت و ساز بدن - ذخیرهسازی و حمل و نقل انرژی - به عنوان اجزای اساسی تمام غشاها و تنظیم کنندهی ژن ها ایفا میکنند - Dembitsky and Maoka,
. - 2007 اسیدهای چرب در صنعت داروسازی به عنوان مواد اولیهی غیرفعال، به طور گستردهای استفاده میشوند. همچنین استفاده از فرمولاسیون چربی بهعنوان حامل مواد فعال به سرعت در حال رشد و توسعه است. بیشترین مقدار استفاده از چربیها در مواد دارویی، تولید امولسیون چربی است، اما به عنوان حامل مواد دارویی نیز استفاده میشوند - Miyashita et . - al., 2013
دادههای مطالعات اپیدمیولوژیکی و مشاهدات عینی نشان می دهد که خطر ابتلا به بیماری عروق کرونر قلب، درکسانی که میزان بالایی از PUFA امگا 3 دریافت میکنند، پائینتر است - ; Leaf et al ., 2008; Wang et al., 2006; Nomura et . - al., 2013 در حال حاضر منبع اصلی PUFA های زنجیر بلند، ماهیهای دریایی میباشند که این ذخایر در حال کاهش است. با توجه به اینکه Worm و همکاران در سال 2009 کاهش شدید تولید صنعت آبزیان را در سال 2048 پیشبینی کرده-اند بنابراین جستجوی منابع جدید از PUFA ها ضروری است - Miyashita et al., 2013 - هرچند جلبکها از نظر محتوای چربی به طور قابل توجهی پایینتر از ماهیها هستند اما با توجه به ذخیرهی بسیار بالایی که دارند به عنوان منبع بالقوهای از چربیهای کاربردی در آبهای ساحلی، مورد استفاده میباشند . - Nomura et al., 2013 -
هدف از تحقیق حاضر، شناسایی و بررسی مورفولوژیک و مولکولی گونه غالب جلبک های قهوهای ساحل اوولی در استان بوشهر و همچنین بررسی محتوای اسیدهای چرب آنها بوده است. با توجه به فراوانی و تنوع گسترده جلبک های قهوه ای در سواحل خلیج فارس، می توان با بهره برداری بهینه و پایدار از این منابع ارزشمند دریایی در صنایع مختلف پزشکی، داروسازی، آرایشی بهداشتی، کشاورزی و غذایی استفاده نمود.
مواد و روشها
نمونهبرداری در اسفند ماه 1395 در زمان جزر کامل از ساحل اوولی جنوبی استان بوشهر انجام شد. ابتدا جلبکهای جمع-آوری شده با آب دریا شست و شو داده شدند تا ذرات شن و ماسه و جانداران اپی فیت جدا شوند. سپس جلبکها در بسته-های فیبری حاوی یخ به منظور جلوگیری از فساد، جهت انجام عملیات آزمایشگاهی به آزمایشگاه منتقل شدند. بخشی از نمونههای جلبکی جهت شناسایی مورفولوژیکی در فرمالین % 4 با آب دریا قرار داده و تثبیت شدند. سپس از قسمتهای مختلف جلبکها از جمله برگ، وزیکول و ساقه ، برشهای عرضی تهیه شد و بعد از قرار دادن بر روی لام، با میکروسکوپ نوری مشاهده گردید .
- Ni-Ni-Win et al., 2011 - شناسایی مورفولوژیکی گونه ها با استفاده از کلید شناسایی معتبر - ; - Nguyen, 2015 Devi et al., 2014 Roberts, 1967 انجام شد. نمونههای جلبکی به منظور شناسایی مولکولی در فریزر -20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. به منظور استخراج DNA جلبکها، از روش - Phillips et al ., 2000 - CTAB با اندکی تغییرات استفاده شد. به منظور بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده و همچنین تعیین خلوص آن، به ترتیب از روش های اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز افقی ژل آگارز استفاده گردید.
سپس تکثیر قطعات ژنومی با استفاده از آغازگر ITS2 انجام شد. واکنش PCR شامل 100 نانوگرم DNA، آنزیم Taq Polymerase بهمقدار 5 u/U، MgCl2 با غلظت 50Mm، بافر 10X، dNTP با غلظت 10mM، آغازگرهای Forward و - Yoshida et al., 2000 - Reverse هر کدام به غلظت 10 پیکومول بر میکرولیتر بود. برنامه حرارتی PCR بصورت مرحله واسرشته سازی شامل یک سیکل، 93 درجه سانتیگراد در یک دقیقه و مرحله دوم شامل سه مرحله واسرشته سازی 94 درجه و سی ثانیه، مرحله اتصال، 55 درجه و سی ثانیه و مرحله بسط 72 درجه و سی ثانیه و به تعداد 35 سیکل و در نهایت، مرحله سوم بسط نهایی شامل 72 درجه سانتیگراد و بهمدت 10 دقیقه انجام شد. پس از حصول اطمینان از کیفیت محصول PCR، قطعات تکثیر یافته نمونه جلبکی جهت توالی یابی ارسال شدند.
سپس توالی قطعات ژنومی با استفاده از نرم افزار Chromas pro، BioEdit و MEGA 7 مورد بررسی قرار گرفته و درختهای فیلوژنی Neighbor Joining و Fast Minimum Evolution جهت بررسی قرابت های ژنتیکی با گونه-های دیگر و همچنین تعیین جایگاه گونه مورد مطالعه رسم گردید. بهمنظور استخراج اسید چرب جلبک قهوهای، در این تحقیق از روش - Nomura et al., 2013 - با اندکی تغییرات استفاده شد. 10 گرم پودر جلبک در ظرف اتوکلاو شده ریخته و ده برابر آن - w/v - ، کلروفرم- متانول - با نسبت 1 به - 2 اضافه و در در دمای اتاق و تحت تاریکی به مدت دو ساعت قرار داده شد.
محلول به وسیله ی پمپ خلا و قیف بوخنر فیلتر شد و باقی ماندهی آن در معرض کلروفرم- متانول - با نسبت 1 به - 2 و به مدت 2 ساعت قرار داده شد. محلول دو باره فیلتر شد و باقی-ماندهی جلبکی این بار در معرض ده برابر - w/v - کلروفرم- متانول- آب - با نسبت 1 به 2 به - 0/8 و به مدت یک تا دوساعت قرار گرفت. محلول دوباره به وسیلهی پمپ خلا و قیف بوخنر فیلتر شد. تمام عصاره های حاصل از سه استخراج با هم ترکیب شدند و حلال توسط روتاری خلا و در دمای 30-31 درجه سانتیگراد حذف شد. عصارهی خشک دوباره در کلروفرم- متانول-آب - با نسبت 8 به 4 به - 3 در قیف جداکننده حل شدند و قیف به شدت تکان داده شد.
لایهی پایینی جدا شد و در دستگاه روتاری قرار گرفت و آخرین نشانههای حلال باقیمانده و آب حذف شدند و تنها مایع چسبناک سبز رنگی باقی ماند. اگر حلال به مقدار زیاد حذف شد و باقیمانده به دیوارهی بالن روتاری چسبیده بود میتوان دوباره به آن کمی کلروفرم اضافه کرد و دوباره در دستگاه روتاری قرار داد. محتوای چربی کل بر اساس mg/g وزن خشک بیان گردید.
نتایج
براساس کلیدهای شناسایی و مشاهدات ماکروسکوپی و میکروسکوپی، نمونهی جلبک قهوهای گونه Sargassum muticum شناسایی شد. تالس جلبک مذکور متراکم و به رنگ قهوهای مایل به سبز زیتونی است.
