بخشی از مقاله
خلاصه:
نماتدهاي زخم ریشه از عوامل مهم کاهش محصول گندم در بیشتر مناطق کشت گندم بحساب می آیند. براي بررسی این بیماري در خوزستان از خاك مزارع و ریشه گیاهان گندم در شهرستانهاي مسجدسلیمان، بهبهان، باغ ملک و شوشتر نمونه برداري بعمل آمد. در ابتدا بررسی هاي مورفولوژیک نمونه ها نشان داد که گیاه گندم در تمام مناطق مورد بازدید به درجات متفاوت به نماتد زخم ریشه گونه هاي Pratylenchus thornei و P. neglectus آلوده بود. جهت شناسایی مولکولی این دو گونه DNA نماتدها با استفاده از روش اصلاح شده مدنی و همکاران استخراج و با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی PCR انجام شد.
پرایمرهاي فوروارد - - PTHO,PNEG استفاده شده از بخش هاي متغیر دومین D3 در زیر واحد بزرگ RNA ریبوزومی هسته اي طراحی شدند که این بخش متغیر امکان شناسائی گونه هاي متفاوت را امکان پذیر می کند. پرایمرهاي بک وارد نیز از بخش هاي ثابت دومین D3 طراحی شدند. پرایمرهاي اختصاصی PTHO/D3B براي گونه P. thornei یک باند DNA با 288 جفت باز تولید کرد و پرایمرهاي اختصاصی PNEG/D3B5 گونه P. neglectus باندي با تعداد 144 جفت باز تولید کرد. همچنین پرایمر هاي اختصاصی هر گونه براي گونه دیگر باندي تکثیر نکردند.
مقدمه
در بین غلات، گندم مهمترین غله ایران و جهان محسوب می شود که استان خوزستان در خلال سال زراعی1387-88 با میزان 10/4 میلیون تن تولید کشور مقام دوم را به خود اختصاص داده بود . - 1 - نماتدهاي زخم ریشه - Pratylenchus spp. - از مهمترین نماتدهاي خاکزاد گندم در دنیا محسوب می شوند. این نماتدها روي ریشه گیاهان آلوده نقاط نکروتیک واضحی ایجاد می کنند.
مطالعات نشان داد که گونه هاي P. thornei و P. neglectus بیشترین فراوانی را در ایران دارند - . - 6 تاکنون شناسایی گونه هاي Pratylenchus متکی بر اختلافات مرفولوژیکی در میان گونه ها بوده هر چند که مرفولوژي کلی تمام گونه ها مشابه است. ال بنا1و همکاران توانستند گونه هاي Pratylenchus brachyurus ، P. penetrans، P.vulnus، P.scribneri، P. thornei و P. neglectus را در یک ترکیب مختلط با هم توسط پرایمرهاي اختصاصی گونه، شناسایی کنند.
شناسایی این گونه ها با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی صورت گرفت که از این میان پرایمرهاي فوروارد2 اختصاصی PTHO و بک وارد1 اختصاصی D3B براي گونه - 2 - P. thorneiو یان2 و همکاران پرایمرهاي فوروارد اختصاصی PNEG و بک وارد اختصاصی D3B5 براي گونه P. neglectus از توالی هاي ژن 28S rRNA طراحی کردند - . - 10
مواد و روش ها
جهت فراهم کردن جمعیت هاي مختلفی از هر دو گونه P. thornei و P. neglectus، از مزارع گندم آلوده شهرستانهاي مختلف استان خوزستان - شوشتر، باغملک، بهبهان و مسجد سلیمان - نمونه برداري انجام شد. سپس نماتدها از خاك - - 4 و ریشه هاي آلوده - - 9 استخراج و با استفاده از محیط کشت هویج تکثیر داده شدند. . - 3 - استخراج DNA نماتدها به روش مدنی و همکاران با مختصري تغییر به شرح زیر انجام شد:
در هر تیوپ میکروسانتریفوژ 1/5ml سترون، تعداد 10 نماتد و 10 میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر و 0/6 mg/ml 3 - میکرولیتر - آنزیم پروتئیناز K و بافر 1X mg-free thermophilic DNA polymerase reaction به مقدار 3 میکرولیتر اضافه شد . سپس 25 میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر به نمونه اضافه گردید و نمونه ها در 65 درجه سانتیگراد براي 1 ساعت در حمام آب نگهداري شدند. پس از آن نمونه ها به مدت 15 دقیقه در دماي 95 درجه سانتیگراد قرار گرفته و در پایان در -20 درجه سانتیگراد ذخیره شدند - . - 5
نتایج
روش استخراج DNA استفاده شده، موفقیت آمیز بود و نماتدها ردیابی شدند. کاربرد پرایمرهاي اختصاصی PNEG و D3B5 براي گونه P. neglectus منجر به تولید محصول PCR با تعداد 144 جفت باز کردند - شکل - 1 ولی این پرایمرها با DNA استخراج شده از گونه P. thornei هیچ محصولی تولید نکردند . همچنانکه انتظار می رفت، پرایمرهاي اختصاصی PTHO/ D3B گونه P. thornei یک باند اختصاصی با 288 جفت باز تولید کردند - شکل - 2 ولی با DNA گونه P. neglectus هیچ باندي ایجاد نشد. نتایج حاصل از تکثیر با کنترل منفی آب مورد مقایسه قرار گرفتند.
بحث
شناسایی مرفولوژیکی ي گونه هاي P. thornei و P. neglectus اغلب به علت مشکلات و اشتباهات بسیار در ریخت شناسی وقت گیر و به کارشناس مجرب نیاز دارد. اما روش هاي شناسایی مولکولی براي شناسایی و تعیین کمی پاتوژن هاي گیاهی داراي دقت و سرعت بالا می باشند. همچنین این روش ها کمتر تحت تاثیر پارامترهاي محیطی قرار می گیرند. در نتیجه مارکرهاي ژنتیکی در ژنوم میتوکندریایی وrRNA ریبوزومی هسته اي براي شناسایی گونه ها استفاده می شوند . - 2 - در این تحقیق از دو جفت پرایمر اختصاصی جهت تکثیر استفاده گردید .
براي گونه P. thornei پرایمر اختصاصی PTHO توصیف شده توسط آل بنا و همکاران استفاده شد - - 2 که نتیجه آن تولید یک باند با 288 جفت باز بود ولی پرایمر فوق با DNA گونه P. neglectus هیچ باندي ایجاد نکرد، همچنین پرایمر اختصاصی PNEG در گونه - 11 - P. neglectus، باندي با تعداد 144 جفت باز تولید کرد ولی با DNA گونه P. thornei هیچ باندي مشاهده نشد.
این با نتایج یان و همکاران مطابقت دارد - . - 10 این گونه ها از طریق اختلاف در اندازه قطعات حاصل از PCR بعد از الکتروفورز از هم تفکیک شدند. لازم به یادآوري است که پرایمرهاي فوروارد - - PTHO,PNEG استفاده شده در این تحقیق از بخش هاي متغیر دومین D3 در زیر واحد بزرگ RNA ریبوزومی هسته اي طراحی شده اند چرا که این بخش متغیر امکان شناسائی گونه هاي متفاوت را امکان پذیر می کند. پرایمرهاي بک وارد از بخش هاي ثابت دومین D3 طراحی شده اند. علت استفاده از دو بخش متفاوت حفظ شده در دومین D3 این است که طول قطعات تکثیر شده جهت شناسائی باید متفاوت بوده و از همدیگر قابل شناسائی باشند.
