بخشی از مقاله
چکیده :
دو ژن PPARGC1A - واقع بر کروموزوم 6 گاو - و DGAT1 - واقع در انتهاي سانترومر 14 گاو - به عنوان ژن هاي کاندید براي تولید شیر و اجزاء شیر شناخته شده است. در این تحقیق DNA ژنومی 400 رأس گاو هلشتاین از استان هاي تهران و اصفهان استخراج شد؛ و یک قطعه 411 جفت بازي از اگزون - 8 ژن - DGAT1 با روش PCR تکثیر شده و با آنزیم برشیCfr I هضم، سپس تعیین ژنوتیپ گردید و فراوانی الل هاي K و A به ترتیب 0/37 و 0/63 محاسبه شد.
تست کاي مربع بیانگر عدم وجود تعادل در فراوانی هاي ژنی این جایگاه در نمونه هاي مورد مطالعه بوده است یک قطعه 195 جفت بازي نیز واقع در اینترون 9 ژن PPARGC1A در موقعیت - 1892 - با روش PCR تکثیر و سپس با آنزیم Hae III هضم و تعیین ژنوتیپ گردید، فراوانی هاي اللیC و T به ترتیب 0/56 و 0/44 محاسبه شد و آزمون کاي مربع بیانگر عدم وجود تعادل هاردي واینبرگ در سطح - P ‹0/05 - بود. عدم تعادل را می توان بدلیل نمونه گیري از جمعیت که خود به نوعی انتخاب محسوب شده و تلاقی هاي غیر تصادفی دانست.
مقدمه :
بهبود ژنتیکی جمعیت هاي دامی با انتخاب بر اساس صفات کمی ایجاد شده است و بیشتر این انتخاب ها بر مبناي فنوتیپ حیوان بدون در نظر گرفتن ساختار ژنتیکی می باشد. استفاده از روش هاي ژنتیک مولکولی در جمعیت هاي دامی منجر به شناخت ساختار ژنتیکی صفات کمی شده است - . - 3 مطالعات بیانگر QTL هایی است که بر صفات تولیدي شیر موثرند و بیشتر آنها بر روي کروموزوم 6 قرار دارند.
یکی از ژن هایی که بر روي کروموزوم 6 قرار دارد PPARGC1A است که به عنوان ژن کاندید موثر بر مقدار چربی شیر تشخیص داده شده است زیرا این ژن نقش اساسی در متابولیسم گلوکز، چربی و انرژي دارد - . - 12 ارتباط معنی داري بین چند شکلی تک نوکلئوتیدي در اینترون - PPARGC1A 9در نزدیکی نشانگر - BM143 با مقدار چربی شیر در گاوهاي هلشتاین آلمان مشخص گردید - . - 1ژن DGAT1 نیز در انتهاي سانترومر کروموزوم 14 به عنوان یک ژن کاندید براي درصد چربی و تولید شیر بوده که با کد کردن آنزیم دي اسیل گلیسرول ترانسفراز نقش اصلی در سنتز تري گلیسرید و در نهایت چربی شیر دارد - . - 6
موتاسیون تک نوکلئوتیدي که منتج به جایگزینی غیر محافظت شده لیزین به وسیله آلانین - K232A - می شود اثر اصلی و بزرگی بر روي تولید شیر و ترکیبات آن ایجاد می کند الل DGAT1K - الل جهش نیافته - نسبت به الل DGAT1A - جهش یافته - حدود 0/34 درصد چربی، 0/08 درصد پروتئین و 46/1 کیلوگرم چربی بیشتر تولید می کند در حالیکه تولید شیر و پروتئین را به ترتیب 3/16 و 5/64 کیلوگرم کاهش می دهد - - 6 لذا به خاطر تاثیر این دو ژن روي صفات تولید و ترکیب شیر بررسی و تعیین خصوصیات ناشی از جهش در گاوهاي هلشتاین ایران امري ضروري به نظر می رسد.
مواد و روشها :
در مطالعه حاضر 400 رأس گاو هلشتاین از گاوداري هاي استان تهران و اصفهان انتخاب و خونگیري از سیاهرگ دمی با استفاده از ونوجکت هاي حاوي ماده ضد انعقاد EDTA - به میزان 0/1 حجم خون تازه، 0/5 EDTA مولار - انجام شد. استخراج DNA از نمونه هاي خون کامل به روش نمکی تغییر داده شده - میلر و همکاران - 1988 انجام و کیفیت و کمیت DNA با استفاده از دو روش اسپکتوفتومتري و نانودراپ تعیین گردید.
به کمک واکنش زنجیره اي پلی مراز و با استفاده از آغازگر A؛ تکثیر یک قطعه 195 جفت بازي واقع در اینترون 9 ژن PPARGC1A جهت تعیین ژنوتیپ چندشکلی تک نوکلئوتیدي T›C در موقعیت 1892 و آغازگر B جهت تکثیر یک قطعه 411 جفت بازي واقع در اگزون 8 ژن DGAT1 که در برگیرنده جایگزینی K232A در موقعیت 10433 می باشد استفاده گردید.
واکنش زنجیره اي پلی مراز در حجم 20 میکرولیتر با محتواي 100 نانوگرم DNA ژنومی، PCR بافر 1x، 2mM Mgcl2، 200µM dNTPs، هر آغازگر 0/5µM و 1/5 واحد Taq DNA polymerase پلی مراز با استفاده از دستگاه ترمال سایکلر Biosystem Applied مدل 9700 انجام شد. واکنش زنجیره اي پلی مراز براي 35 چرخه و در شرایط 94˚c بمدت 60 ثانیه، 60˚c بمدت 60 ثانیه و 72 ˚c بمدت 60 ثانیه انجام گرفت.
سپس محصولات تکثیر شده در واکنش زنجیره اي پلیمراز به ترتیب توسط آنزیم هاي Hae III و Cfr I به طور جداگانه هضم شدند. براي این منظور 10 میکرولیتر از هر محصول تکثیر شده، همراه با 2 واحد آنزیم و بافر آنزیم به مدت 3 ساعت در حرارت 37 درجه سانتیگراد در بن ماري هضم شدند. پس از آن نمونه هاي هضم شده بر روي ژل آگارز %2 بارگذاري و با روش اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي و تعیین ژنوتیپ شدند.
نتایج و بحث :
نتایج حاصل از بارگذاري نمونه هاي هضم شده DGAT1 نشان دهنده 3 ژنوتیپ KA , AA ,KK می باشد که افراد KK بدون جهش بوده در ناحیه 411 جفت بازي داراي باند هستند، افرادKA تنها در یک الل آنها جهش رخ داده در دو ناحیه 411 جفت بازي و 203 یا 208 جفت بازي داراي باند هستند و افراد AA در هر دو الل آنها جهش صورت گرفته داراي 2 باند در ناحیه 203 یا 208 جفت بازي هستند - شکل. - 1 از 400 فرد تعیین ژنوتیپ شده 2 فرد براي آغازگر DGAT1 داراي الل خاموش - اللی که اثرش یا به صورت فقدان محصول طبیعی در سطح مولکولی و یا به صورت غیر طبیعی در سطح فنوتیپی بروز می کند - بوده و 36 فرد داراي ژنوتیپ KK ، 226 فرد داراي ژنوتیپ KA و 136 فرد داراي ژنوتیپ AA بودند.
بیشترین فراوانی ژنوتیپی مربوط به ژنوتیپ KA به میزان 0/56 محاسبه گردید - جدول . - 1 مقدار فراوانی اللی محاسبه شده در تحقیق حاضر با فراوانی اللی محاسبه شده توسط گوتیو و همکاران - 2007 - که فراوانی الل K و A به ترتیب 0/36 و 0/64 محاسبه کرده بودند تقریبا مطابقت داشت. میزان بالاي شاخص شانون و نئی نشان از تنوع ژنتیکی قابل توجه در جمعیت مورد مطالعه می باشد براي نسبت هاردي واینبرگ از دو آزمون کاي مربع و نسبت درشت نمایی استفاده گردید و نتایج حاصل نشان داد که جمعیت مورد مطالعه از تعادل هاردي واینبرگ انحراف دارد.
