بخشی از مقاله
چکیده :
1OLWS یک بیماري ژنتیکی مغلوب است که در کره هاي تازه متولد شده اسب هاي رنگی امریکایی و اسب تروبرد مشاهده می شود. هر دو والد ناقل ژن معیوب هستند. کره هاي مبتلا به این بیماري در هنگام تولد، سفید کامل و یا تقریبا سفیدند و در مدت چند روز از پیامدهاي ناشی از نقصان گره عصبی روده می میرند. یاخته هاي ملانوسیت - رنگدانه اي - و یاخته هاي گره عصبی روده داراي خاستگاه یکسان - از یاخته هاي نورال کرست - می باشند.
یک جهش دو نوکلئوتیدي TC - به - AG در کدون 118 در ژن 2EDNRB روي کروموزوم شماره 17 اسب، که سبب جایگزین شدن اسید آمینه لیزین - Lys - به جاي اسید آمینه ایزولوسین - Ile - می شود، عامل این بیماري است. در این پژوهش، به منظور شناسایی والدهاي ناقل و جلوگیري از ورود آلل هاي معیوب به مخزن ژنی اسب هاي کشور، 60 اسب تروبرد بررسی شدند. براي شناسایی ناقل ها از آغازگرهاي اختصاصی بهره گرفته شد. نتایج نشان داد همه اسب هاي تروبرد این مطالعه براي آلل lle118 هموزیگوت هستند که بیانگر سالم بودن آنهاست.
مقدمه :
اسب تروبرد یکی از با ارزش ترین و سریع ترین اسبهاي کورس جهان است. اندامی بلند و نیرومند، گردن کشیده و شانههایی مورب و قوي، پشت و کمر نسبتاً کوتاه با کپل عضلانی و دست و پاهایی محکم و استواردارد . - 1 - از این نژاد هم اینک نزدیک به 200 راس در ایران وجود دارد. OLWS یک ناهنجاري ژنتیکی مغلوب است که در کره اسبهاي نژادهاي رنگی آمریکایی، کوارتر و تروبرد دیده می شود
با رویکرد به اهمیت الگوهاي رنگی مختلف در پرورش جانوران اهلی، گزینش و حفظ این الگوها اهمیت ویژه اي دارد - . - 6 این بیماري بیشتر از راه آمیزش اسبهایی با یک الگوي رنگی ویژهبه نام اُورو پدید می آید - . - 5 اسبهاي داراي الگوي رنگی اوورو یک نسخه تنها از ژن ایجاد کننده این الگوي رنگی را دارند که رنگدانه ها را از میان می برد - . - 6 این عمل سبب ایجاد لکه هاي سفید در نواحی خاصی از پوست بدن و زیبایی اسب می گردد. اما این ژن با ایجاد یک وضعیت کشنده به نام OLWS مرتبط است
کره هاي بیمار اگر چه از دید ظاهري - بجز سفید بودن رنگ پوست - طبیعی به نظر می رسند، ولی نمی توانند مواد هضمی را در دستگاه گوارش خود - روده - حرکت دهند و حدود 24 ساعت پس از تولد، کولیک - انسداد روده اي - و درد در ناحیه شکمی شکل گرفته و ناگهانی خواهند مرد
از دیدگاه رویان شناسی هر دو نوع یاخته هاي ملانوسیت - یاخته هاي رنگدانه اي - و گره هاي عصبی داراي خاستگاه یکسان یاخته هاي نورال کرست هستند و ایجاد نقص در مهاجرت آن ها از نورال کرست، به عدم وجود ملانوسیت ها در پوست و سلول هاي گره عصبی در روده می انجامد - . - 4 الزامی نیست که کره هاي داراي الگوي رنگی کاملا سفید، به OLWS مبتلا باشند . الگوهاي رنگی سفید غالب و پاره اي از کره هاي هتروزیگوت ممکن است به طور کامل سفید بوده و در عین حال نقصی در یاخته هاي گره هاي عصبی نداشته باشند
نقص ژنتیکی ایجاد کننده بیماري، جهش دو نوکلئوتیديTC به AG در نوکلئوتیدهاي 353 و 354 کدون 118 ژن کد کننده گیرنده اندوتلین - EDNRB - B که روي کروموزوم شماره 17 جاي دارد، است. این جهش سبب تغییر اسید آمینه ایزولوسین به لیزین می گردد - EDNRB . - 7 براي رشد طبیعی گره هاي عصبی روده و ملانوسیت ها در درون یاخته هاي نورال کرست لازم است - . - 2 کره هاي مبتلا، براي آلل لیزین، هموزیگوت - Lys118/Lys118 - بوده اما کره هاي ناقل هتروزیگوتند
- Ile118/Lys118 - توارث این بیماري به شکل آتوزومی مغلوب است - . - 3 بودن تنها یک آلل جهش یافته براي ایجاد اُورو کافیست در حالی که بودن دست کم یک آلل نرمال جلوي ایجاد ناهنجاري در تشکیل یاخته هاي گره هاي عصبی در دستگاه گوارش - فنوتیپ - OLWS را می گیرد. کره هاي سفیدرنگ بدون نشانه هاي بیماري کولیک ممکن است هموزیگوت نبوده و براي تشخیص دقیق تر آزمایش ژنتیکی باید روي آن ها انجام شود. افزون بر این امکان شناسایی اسبهاي ناقل و بدون نوتیپف الگوي رنگی اُورو نیز هست که نشانگر متفاوت بودن میزان نفوذ جهش است
مواد و روش ها : خونگیري از 46 مادیان و 14 نریان انجام شد. همه نمونه ها از استان البرز گرداوري شدند. استخراج DNA به روش نمکی - Salting out - انجام و چگونگی آن به کمک ژل آگارز %1 بررسی شد. براي هر اسب، دو واکنش PCR جداگانه طراحی شد. یک واکنش داراي جفت آغازگر تکثیرکننده آلل Ile118 بود - آغازگرهاي رفت و برگشت 5-GTTCGTGCTGGGCATCATC-3 و - 5-GTGCAGCAAGTCTCCCAGAG-3 که قطعه هدف آن 118 جفت بازي است. واکنش دیگر داراي جفت آغازگر تکثیر کننده آلل Lys118 - آغازگرهاي رفت و برگشت 5GTTCGTGCTGGGCATCAAG-3 و - 5-GGGGATGTCAATGATGATGTG-3 که قطعه هدف آن 136 جفت بازي است
- عکس - 1 بخشی از cDNA و توالی اسید آمینه ژن EDNRB در اسب. جهش TC به AG در کدون 118، به جایگزینی ایزولوسین - Ile - با لیزین - Lys - انجامیده است. جایگاه اتصال جفت آغازگر تکثیرکننده Ile118 - که قطعه هدف آن 118 جفت باز است - با خط هاي نازك و جایگاه اتصال جفت آغازگر تکثیرکننده Lys118 - که قطعه هدف آن 136 جفت باز است - با خط هاي کلفت نشان داده شده است.
براي اطمینان از درستی و تکرار پذیري محصولات PCR، سه تکرار انجام شد. در تکرارهاي نخست و دوم، DNA با غلظت 200 نانوگرم و در تکرار سوم، با غلظت 25 نانوگرم PCR شد. غلظت نهایی دیگر مواد PCR در هر سه تکرار به این شرح بود: PCR Buffer 1X، 1 MgCl2 میلی مولار، 0/25 dNTPs میلی مولار، آغازگرها 0/2 میلی مولار، Taq پلیمراز .2U حجم واکنش، 25 میکرولیتر و برنامه PCR، 35 چرخه 95 - درجه در 30 ثانیه، 56 درجه در 2 دقیقه و 72 درجه در 45 ثانیه - بود. از دستگاه ترمال سایکلر ASTEC مدل PC818 بهره گرفته شد. فراورده هاي PCR روي ژل هاي آگارز با خلوص بالا و غلظت %2 - تاپ ویژن - بارگزاري و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي و تعیین ژنوتیپ شدند.
نتایج و بحث : اوورو داراي ارزش بسیاري در الگوي رنگ در اسبهاي رنگی است ولی درصد قابل توجهی از نتایج جفت گیري دو اسب اوورو، کره هاي OLWS می باشد - . - 8 با توجه به بکارگیري دو جفت آغازگر جداگانه، انتظار تکثیر قطعه 136 جفت بازي براي Lys118 - در صورت وجود - و تکثیر قطعه 118 جفت بازي براي Ile118 را داشتیم.
نتایج نشان داد که هیچ کدام از نمونه ها هتروزیگوت - ناقل - نیستند. بدین معنا که در PCR مربوط به Lys118 هیچ باندي دیده نشد. ولی همه نمونه ها در PCR مربوط به Ile118، داراي باند بودند. این نتیجه نشان میدهد که جهش دو نوکلئوتیدي TC - به - AG در کدون 118 از ژن EDNRB در هیچ یک از این اسبها رخ نداده است. پس همه 60 نمونه اسب تروبرد این پژوهش، در مورد اسید آمینه ایزولوسین در کدون 118، هموزیگوتند. این مسئله سالم بودن این نمونه ها را تایید می کند
- عکس - 2 یک ژل آگارز اینویتروژن %2 ، فراورده هاي PCR و نوارهاي گرفته شده ایزولوسین - قطعه 118 جفت باز - را نشان می دهد. ستون نخست و آخر، شاخص نردبان - Ladder - می باشند. ستونهاي شماره گذاري شده از 1 تا 10، مربوط به هرکدام از نمونه ها می باشد.
هر ستون داراي دو چاهک است. چاهک نخست هر ستون، فراورده PCR نمونه - فرد - را با آغازگرهاي ویژه تکثیر قطعه ایزولوسین - Ile118 - نشان داده و چاهک دوم هر ستون، فراورده PCR همان نمونه - فرد - را با آغازگرهاي ویژه تکثیر قطعه لیزین - Lys118 - نشان می دهد. ستون 11، فراورده PCR هاي شاهد آب - کنترل منفی - می باشند. این عکس نشان می دهد که قطعه ایزولوسین در همه اسبها تکثیر شده ولی قطعه لیزین نه. این مسئله سالم بودن اسب ها را نشان می دهد. -
