بخشی از مقاله
چکیده
از مهمترین عوامل کاهش چشمگیر برداشت در واحد سطح پسته باغات استان کرمان در سالهای اخیر تنش خشکی و شوری است. قارچهای میکوریز به عنوان یکی از مهمترین اجزای ریزوسفر گیاهان که بعنوان یک کود آلی در کشاورزی پایدار محسوب میشوند. قارچهای میکوریز سبب کاهش اثرات مخرب تنشهای محیطی بر گیاه و افزایش رشد گیاه در شرایط نامناسب میباشند.
تحقیق حاضر برای شناسایی قارچ های همزیست با درختان پسته در مناطق با شوری و خشکی شدید انجام شده است. علاوه براین نتایج با گیاهان بومی مناطق غیر کشاورزی مقایسه شده است. سه جنس Claroideoglomus، Funneliformis و Rhizophagus به عنوان جنسهای غالب باغات پسته میباشند. تنوع گونه در مناطق غیر کشاورزی بیشتر از باغات پسته بود. بررسی سرعت کلنیزاسیون ریشه توسط قارچ نشان داد به ترتیب Diversispora ، Funneliformis ، Rhizophagus ،Claroideoglomus ، و Racocetra گیاه را کلنیزه میکنند.
مقدمه
کشور ایران با مساحت بیش از 1/6 میلیون کیلومتر مربع، شانزدهمین کشور بزرگ جهان است که دارای ارتفاع 5000 متر از سطح دریا میباشد. ایران به طور متوسط دمای بین -30 تا 50 درجه سانتی گراد دارد. میانگین بارش سالانه از 25 میلی متر در فلات مرکزی تا بیش از 2000 میلیمتر در سواحل دریای خزر متغییر است که متوسط بارش سالانه 228 میلیمتر گزارش شده است. ایران از سال 2000 میلادی وارد فهرست کشورهای دارای کسری آب شده است و تا سال 2030 منابع آب تجدیدپذیر آن از 1500 متر مکعب برای هر نفر در سال کمتر خواهد شد Yang - و همکاران، . - 2003 حدود 90 درصد از مساحت کشور در ناحیه خشک و نیمه خشک قرار دارد.
تنش خشکی مهمترین عامل محدود کننده در تولید در مناطق کشاورزی نیمه خشک به شمار میرود. گیاهان در اثر خشکی، علاوه بر واکنشهای فیزیولوژیک، تغییرات مورفولوژیک نیز از خودشان نشان میدهند Yordanov - ، . - 2003 افزایش جمعیت نگرانیهای موجود را برای کمبود غذا در دههای آینده را تشدید کرده است. برای افزایش تولید بالا بردن سطح زیر کشت نیز دارای محدودیت است. در ایران مشکل اصلی برای افزایش میزان تولید زمین نیست بلکه کمبود آب است. با وجود این محدودیت قادر به افزایش سطح زیر کشت نخواهیم بود.
بلکه از میزان آب و زمین مورد استفاده باید حداکثر بهره وری را داشته باشیم. از جمله راهکارهای افزایش تولید، بهبود روشهای آبیاری، استفاده متعادل از کودها، حفاطت خاک، استفاده از بذرهای اصلاح شده و... میباشد. بنابراین مدیریت اشتباه میتواند تهدید بزرگی در تولید غذا باشد. تولید کود شیمیایی برای اولین بار در سال 1945 به مقدار 60 تن در سال بوده است. در سال 1955 مقذار 176 تن توسط دولت و 305 تن توسط بخش خصوصی وارد کشور شده است.
در سال 2012 حدود 26/3 کیلوگرم در هکتار گزارش شده است. پیش بینی میشود طی سالل های اینده به 6200000 تن برسد و نرخ کارایی مصرف کودها از سال 1989 از 10/8 به 12/5 در سال 2004 رسیده است در حالی که میزان مصرف از1500000تن به بیش از 3000000 تن رسیده است FAO - ، . - 2005 قارچ های میکوریز همزیستی بین ریشه گیاهان و قارچ است که در این همزیستی قارچ میکوریز آب و عناصر غذایی را از ناحیه خارج منطقه تخلیه ریشه جذب و در اختیار گیاه قرار میدهد و در عوض گیاه کربو هیدارت مورد نیاز قارچ را در اختیار آن قرار می دهد. خلوتی و همکاران نشان دادند قارچهای میکوریز تا 20 درصد میزان جذب آب را در گیاهان افزایش میدهند Kothari و همکاران - 1991 - ب ا تلقیح گیاهان ذرت در خاک آهکی با قارچ میکوریز بیان کردند قارچ میکوریز سبب افزایش جذب فسفر و روی در گیاه ذرت شده است.
Marouf و همکاران - 2015 - برای استقرار گیاهان در منطقه تخریب شده توسط فعالیتهای صنعتی از قارچهای بومی استفاده کردند. رشد گیاهان تلقیح شده به طور معنی داری بیشتر بود. بعد از شناسایی مشخص شد قارچها از گونه های Glomus ,Scutellospora ,Gigaspora ,Acaulospora بودند. Song و همکاران - 2015 - بیان ژنها را در گیاهان تلقیح شده با قارچ میکوریز بررسی کردند، 77 پروتئین تغییر قابل توجه داشت و علاوه بر آن 9 پروتئین مربوط به قارچ میکوریز مشخص شد.
با معرفی PCR بزرگترین مشکل بر سر راه استفاده از DNA برداشته شد با پیشرفت این تکنولوژی انالیز ملکولی مقدار کمی از DNAمیکروارگانیسمهای که قادر به کشت انها در محیط اگزونیگ نیستیم همانند قارچ میکوریز امکان پذیر شد. بعد از تخمین زیر واحد کوچک 18s مححققان بر اساس آن برای قارچ میکوریز پرایمر اختصاصی تعریف کردند پرایمر VANS 1 در برخی از مطالعات استفاده شد اما وقتی که بیشتر سکونسهای SSU در دسترس بودند مشخص شد این پرایمر در همه گروهها بخوبی حفاظت شده نیست.
دیگر مححققان از 28S large ribosomal subunit - LSU - استفاده کردند Schubler - et al. 2001 - با توجه به اینکه کرمان به عنوان مهمترین تولید کننده پسته در ایران در منطقه خشک قرار گرفته که علاوه بر خشکی کمبود آب با کیفیت مناسب سبب گسترش شوری در این منطقه شده است که تولید پسته را به شدت کاهش داده است. یکی از راه کارها در کشاورزی پایدار استفاده از کودهای ارگانیک همانند قارچ میکوریز میباشد که سبب کاهش اثرات مخرب تنشهای محیطی میشود بنابراین در این آزمایش به بررسی تنوع و جمعیت قارچهای میکوریز جدا شده از باغات تحت تاثیر تنش شوری و خشکی با استفاده ازQuantitative real-time PCR - qPCR انجام شد. علاوه براین نمونههای جدا شده از باغات پسته با نمونههای مناطق غیر کشاورزی و داری گیاهان بومی مقایسه شد.
مواد و روش ها
برای شناسایی گونههای قارچها با گیاه اندروپگون تلقیح شدند. این ازمایش در قالب طرح کاملا تصادفی و در 4 تکرار انجام شد. برای کشت آنها گلدانهای حاوی - 9:9:2 - زئولیت، شن و خاک استفاده شد.100 گرم مایه تلقیح به صورت یک لایه در عمق 3 سانتی متر گلدادن قرار داده شد وبا یک لایه خاک استریل پوشانده شد در نهایت حدود 50 بذر اندرو پگون - - Andropogon gerardii بر روی خاک قرار داده شد و روی آنها با لایه نازک خاک پوشانده شد. گلدانها در گلخانه قرا داده شدند و به صورت روزانه با آب مقطر آبیاری شدند. بعد از گذشت 7 و 11 هفته ریشهBها از عمق 10 سانتی متری گلدان جمع آوری و بخوبی شسته و در در دمای -20 نگهداری شد.
برای انجام شناسایی ملکولی قارچ های مختلف ابتدا استخراج DNAبا استفاده از کیت NucleoSpin® Plant ساخت شرکت Macherey-Nagel آلمان انجام شد, در این روش ابتدا با DNA از اسپورBهای خالص قارچ میکوریز استخراج شد و به عنوان DNA الگو برای رسم نمودار استاندارد در سریهای رقت مختلف استفاده شد. نمودار استاندار برای قارچهای میکوریز بدست آمد. Quantitative real-time PCR - qPCR - استفاده از پرایمر های اختصاصی 6 گونه قارچ میکوریز مربوط به زیر واحد بزرگ ریزوبومی - LSU - و کاوشگر فلورسنت انجام شد . - Thonar et al. 2012 - پرایمرهای 6 گونه قارچ میکوریز بررسی شده شامل Funneliformis، Diversispora، Gigaspora margarita، Rhizophagus، Claroideoglomus و Racocetra Scutellospora pellucida - بودند. برای آنالیز آماری نتایج از نرم افزار SAS 9.1و برای رسم نمودارها از EXCEL2016 استفاده شد.
نتایج و بحث
مایه تلقیح قارچهای میکوریز بخوبی ریشه گیاه اندروپگون را کلنیزه کرد. بررسی تنوع جمعیت قارچ میکوریز نشان میدهد در نمونههای مربوط به پسته، در برداشت اول بجز در نمونه 6 قارچ Funneliformis غالب بوده، ولی در نمونه 6 قارچ Racocetra غالب بوده است. در گیاهان بومی تنوع گونههای قارچ نسبت به گیاه پسته بیشتر بوده است. بطوریکه در نمونه های 10 و Rhizophagus 30 در Racocetra 10 و در Claroideoglomus 26 گونه غالب قارچ را تشکیل داده اند. - Oehl et al., 2003 - نشان دادند قارچ های میکوریز در نواحی بدون کشاورزی دارای جمعیت بالاتری نسبت به نواحی کشت هستند.شاید بتوان اثر گیاهان میزبان را در نوع گونه قارچ موثر دانست که با نتایج سایر محققین که گزارش کردند قارچهای میکوریز همزیست اختصاصی نیستند ولی گیاهان و همچنین قارچ ها انتخاب ترجیحی دارند توافق دارد
بیشترین فراوانی در برداشت اول به ترتیب قارچهای Funneliformis، Rhizophagus، Racocetra و Claroideoglomus بود و در برداشت دوم Rhizophagus و Funneliformis و در نهایت Claroideoglomus بود. مقایسه دو برداشت نشان میدهد. Funneliformis و Rhizophagus توانسته اند سهم بیشتری از فضای ریشه را کلنیزه کنند و سایر قارچ ها را حذف و خود جایگزین انها شوند. بیشترین جمعیت قارچ Claroideoglomus در نمونه 26 که از گیاهان بومی استخراج شده است بوده است و در مرحله اول برداشت جمعیت آن بیشتر بوده و با رشد گیاه توسط سایر قارچها جایگزین شده است.
در نمونه 26 قارچ 29/58 Claroideoglomus درصد کاهش ولی در نمونه 46 حدود 14/33 درصد نسبت به برداشت اول افزایش پیدا کرده است. Funneliformis هم با افزایش رشد گیاه کاهش پیدا کرده است و بیشترین جمعیت ان مربوط به نمونه های جدا شده از پسته بوده است. بیشترین جمعیت قارچ Rhizophagus در نمونه 29 بوده است که با افزایش رشد و سن گیاه مقدار رشد این قارچ نسبت به برداشت اول بیشتر بوده است. Racocetra در نمونههای گیاهان بومی بیشتر بوده است و بیشترین جمعیت این قارچ در نمونه 30 است و این قارچ در برداشت دوم مشاهده شده است. Diversispora هم با افزایش رشد گیاه جمعیت آن کاهش یافته است و بیشترین جمعیت آن در نمونه 30 که مربوط به گیاهان بومی است مشاهده شده است.
بررسی نمونهها نشان میدهد. به طور کلی در برداشت اول بیشترین تعداد کپی-های LSU در نمونه 6 بوده است و بیشترین تعداد کپیهای LSU را Diversispora داشته است. در برداشت دوم تعداد کپیهای LSU در بیشتر نمونه ها افزایش پیدا کرده که بیشترین آن مربوط 29 و 55 بوده است. بیشترین تعداد کپی-های LSU مربوط به قارچهای Funneliformis و Rhizophagus بوده است.
بصورت کلی نتایج رشد قارچ ها نشان می دهد سرعت جوانه زنی اسپور و کلنیزه کردن ریشه گیاه توسط قارچ ها به ترتیب Diversispora ، Funneliformis ، Rhizophagus ،Claroideoglomus ، و Racocetra بوده است که با نتایج jansaو همکاران 2008 مطابقت دارند انها با تلقیح سه قارچClaroideoglomus ،Funneliformis و Rhizophagus بر روی گیاهان بیان کردن سریعترین رشد را Funneliformis داشته است و کمترین سرعت را در کلنیزه کردن گیاهانClaroideoglomus داشته است و Rhizophagus حد وسط بوده است.
Oehl و همکاران - - 2009 نشان دادند اولین گروه از قارچ های میکوریز گلوموس، بخصوص گلوموس موسه، ابتدا تولید اسپور میکنندو وتعداد اسپورهای این قارچ درمقایسه با سایر قارچ ها بیشتر بود سرعت تولید اسپور درسایر گونه ها کمتر است. همچنین انها نشان دادند اگر قارچ از شرایط سختری جدا شده باشد در شرایط جدید نسب به سایر گونه های جدا شده از شرایط بهتر، اسپور دهی انها در زمان کوتاهتری اغاز میشود.
Brundrett و همکاران - 1999 - نشان دادند تولید اسپور و حوانه زنی آن در گونه های گلوموس وابسته به شرایط قبلی زندگی انها است در صورتی که در اکالوسپورا و دایورسپورا وابسته به خصوصیات ژنتیکی انها است و پس از طی کردن دوره درمانت جوانه زنی آنها اغاز می شود.
