بخشی از مقاله
چکیده
آرباسکولار میکوریزا گستردهترین نوع همزیستی میکوریزایی است که دارای اهمیت اقتصادی و اکولوژیکی فراوان است. به دلیل گستردگی تعداد جنس و گونه قارچهای این همزیستی و محدودیتهای روشهای شناسایی مورفولوژیک، امروزه از تکنیکهای مولکولی برای تکمیل شناسایی آنها استفاده میشود.
در تحقیق حاضر از تکنیک مولکولی PCR آشیانهای براساس توالی ژنهای DNA ریبوزومی برای ردیابی قارچهای میکوریز آرباسکولار همزیست با ریشه گونههای بلوط - Quertcus sp. - جنگلهای هیرکانی استفاده شد. آنالیز فیلوژنتیکی توالیهای بدست آمده با روش بیس - Bayesian method - صورت گرفت که بر اساس نتایج آن 4 گونه از قارچهای میکوریز آرباسکولار - متعلق به دو جنس Acaulospora و - Glomus شناسایی گردید.
نتایج این بررسی نشان داد در کنار جمعیت غالب قارچهای اکتومیکوریز همزیست درختان بلوط؛ قارچهای میکوریز آرباسکولار نیز وجو دارد که اگرچه ردیابی آنها با روشهای مرفولوژیک مشکل است، اما با انجام همزمان روشهای مولکولی میتوان تصویر دقیقتری از آنها در منطقه حتی در جمعیتهای پایین بدست آورد.
مقدمه
همزیستی آرباسکولار میکوریزا تاریخچهای با قدمت بیش از 450 میلیون سال داشته و گستردهترین نوع همزیستی میکوریزایی است که نقش عمدهای در کلونیزاسیون زمین توسط گیاهان دارد. این چنین همزیستی توسط 70-90 درصد گونههای گیاهان خشکیزی با قارچهای خاکزی که متعلق به زیرشاخه مونوفایلتیک Glomeromycotina هستند، تشکیل میشود
اهمیت این همزیستی میکوریزایی در طبیعت و اثرات مفید آن روی بسیاری از فرآیندهای بیولوژیک، موجب توسعه تحقیقات میکوریزایی شده است که اولین و مهمترین گام در تمام آنها، شناسایی دقیق گونه قارچ همزیست است. در گذشته شناسایی قارچهای شرکت کننده در این همزیستی بطور سنتی و با روشهای مورفولوژیک صورت میگرفت، اما با توجه به گستردگی تعداد جنس و گونه این قارچها و از سوی دیگر محدودیتها و مشکلات روشهای مورفولوژیک، امروزه از تکنیکهای جدید مولکولی برای تکمیل شناسایی این قارچها استفاده میشود.
چالش اصلی در شناسایی و سیستماتیک این گروه از قارچها وجود تنوع قابل توجه در گونههای مشخص شده و فقدان ساختارهای تولید مثل جنسی است. بنابراین شناسایی مرفولوژیک این قارچها براساس اندامهایی است - اسپورها و ساختارهای درون ریشهای قارچها - که به روش غیرجنسی ایجاد شدهاند. تولید اسپور همیشه با کلونیزاسیون ریشه همبستگی نداشته و اغلب با پارامترهای فیزیولوژیک قارچ همزیست و شرایط محیطی مرتبط است.
بعلاوه ممکن است دینامیک تولید اسپور و کلونیزاسیون ریشه در میان گونهها متفاوت باشد. از اینرو عدم حضور اسپور یک گونه قارچی،الزاماً نشان دهندهی عدم حضور آن گونه در ریزوسفر نمیباشد و بنابراین در این گونه مطالعات نمیتوان تخمین درستی از تنوع و فراوانی جمعیت قارچهای میکوریز به دست آورد. از سوی دیگر در غیاب اسپورها، ساختارهای درون ریشهای قارچ تنها شناسایی در حد خانواده را ممکن می- سازد. این معیارها علاوه بر نامکفی بودن موجب پیچیدگیهایی در وضعیت ردهبندی این قارچها شده است و از اینرو امروزه تلاش شده با استفاده از روشهای مولکولی این مشکلات مرتفع گردند
در ایران تاکنون تحقیقات فراوانی در زمینه شناسایی قارچهای میکوریز آرباسکولار بومی خاکهای ایران براساس ویژگیهای مرفولوژیک صورت گرفته است اما تاکنون مطالعات معدودی در زمینه شناسایی این قارچها با استفاده از روشهای مولکولی انجام شده است. در تحقیق حاضر، شناسایی قارچهای میکوریزِ همراه با درختان بلوط - سه گونه Quercus castaneifolia C.A.Mey.، Q. macranthera Fisch. and C.A.Mey. و - Q. petraea L. در برخی جنگلهای شمال کشور از طریق آنالیزهای مولکولی و فیلوژنتیکی صورت گرفت؛ که برای این منظور تکثیر و تعیین توالی نواحی ITS این گونههای قارچی برای شناسایی دقیق ریشههای میکوریزایی بکار گرفته شد.
مواد و روشها
نمونهبرداری بطور تصادفی از برخی رویشگاههای بلوط استان مازندران - خیرود و بینشکی - ، گیلان - سیاهکل و شفارود - و گلستان - لوه و توسکستان - از حداقل 10 پایه از درختان سالم بلوط هر رویشگاه با رعایت پراکنش مناسب بعمل آمد. در هر مورد نمونههایی از خاک بهمراه ریشه از قسمت سایهانداز از عمق صفر تا 30-20 سانتیمتری ریزوسفر جمعآوری شد.
با بررسی نمونهها توسط میکروسکوپ و تقسیمبندی ریشههای میکوریزایی با خصوصیات مرفولوژیکی مشابه به دستجات مشخص - مورفوتایپ - ، از مورفوتایپهای غالب هر نمونه تعدادی نوکریشه جداسازی و برای شناسایی مولکولی قارچ همزیست استفاده شد. استخراج DNA ریشهها - حاوی ژنوم گیاه و فلور میکروبی - توسط پروتوکل CTAB صورت گرفت و تکنیک PCR آشیانهای جهت تکثیر ناحیه ITS از DNA ریبوزومی قارچهای میکوریز آرباسکولار توسط آغازگرهای LSU-Glom1 و SSU-Glom1 - در - PCR I و ITS5 و ITS4 - در - PCR II انجام شد . - Renker et al., 2003 - برای ردیابی قطعه DNA ریبوزومی تکثیر شده، الکتروفورز با ژل آگارز 2 درصد انجام گرفت. باندهای تکی و مشخص روی ژل با طول قطعه ITS مورد نظر برای قارچهای میکوریز آرباسکولار - 500bp - - 650 انتخاب و جهت تعیین توالی به شرکت تکاپوزیست ارسال شدند.
توالیهای به دست آمده با استفاده از الگوریتم BLASTN با توالیهای نوکلئوتیدی پایگاه GenBank مقایسه شدند و نزدیکترین توالی به آنها به عنوان توالی مرجع انتخاب شد. به منظور یافتن جایگاه تاکسونومیکی توالیهای به دست آمده، درخت تشابه برای هریک از آنها ترسیم گردید؛ بدین ترتیب که توالی نوکلئوتیدی بدست آمده برای هر نمونه به همراه مشابهترین توالیهای واقع در پایگاه داده به کمک برنامه ClustalX همردیف و تنظیم گردیدند . - Thornhill et al., 2006 - مدل تکاملی مربوطه با استفاده از نرم افزارهای PAUP و MrModeltes2 انتخاب شد. آنالیز فیلوژنی و ترسیم درخت تبارشناسی مربوطه با روش بیس - Bayes - توسط نرمافزار - Ronquist and Huelsenbeck, 2003 - MrBayes v. 3.12 انجام گرفت.
نتایج
در مجموع 217 سیستم ریشهای از رویشگاه های مورد مطالعه جمع آوری شد که بر اساس مشاهدات مرفولوژیکی، 183عددمشخصاً دارای همزیستی اکتومیکوریزایی و 9 عدد محتمل به شرکت در همزیستی آرباسکولار بودند که مورفوتایپ غالب از هریک از آنها جداسازی شد. پس از تلاش برای استخراج DNA از 9 ریشه میکوریز آرباسکولار، 5 عدد توسط پرایمرهای قارچی تکثیر و تولید توالی های DNA خالص که قابل همردیفسازی بود، نمودند.
در مورد سایر نوکریشهها، DNA تکثیر نشد، یا چندین باند تکثیر شده روی ژل آگارز مشاهده گردید که نشان دهنده وجود آلودگی بود و یا اینکه توالی هایی را ایجاد نمودند که قابل همردیفسازی نبودند. پس از مطابقت دهی این توالیها با توالیهای پایگاه داده GenBank با استفاده از آنالیز بلاست، از میان این تعداد DNA تکثیر شده، 4 عدد با تاکسونهایی از قارچهای اندومیکوریز مطابقت داشتند
جدول -1 نتایج شناسایی مولکولی قارچهای میکوریز آرباسکولار همراه ریشههای بلوط در برخی جنگلهای ایران
به این ترتیب مشخص شد که 4 تاکسون قارچهای میکوریز آریاسکولار به 2 جنس تعلق دارند - جدول . - 1 در جهت تلاش برای یافتن جایگاه تاکسونومیکی دقیق توالیهای به دست آمده، در کنار آنالیزهای بلاست، این توالیها مورد آنالیزهای فیلوژنتیکی نیز قرار گرفتند؛ که در ادامه درختهای فیلوژنتیکی هریک از جنسها به همراه موقعیت هریک از تاکسونها آمده است
شکل -1 درخت فیلوژنی حاصل از آنالیز داده های مربوط به ناحیه ITS جنس Acaulospora و Glomus به روش Bayesian. اعداد کنار شاخه به احتمال پسین بیزین - BPP - مربوط هستند.
بحث و نتیجهگیری
تاکنون شناسایی قارچهای میکوریز در مناطق مختلفی از جهان در مطالعات متعددی با اهداف اقتصادی و یا اکولوژیکی صورت گرفته است. در دهه اخیر، تکنیکهای مولکولی تکثیرِ DNA برای حل بخشی یا تمام چالشهای اکولوژیکی و سیستماتیکی مرتبط با شناسایی ارگانیسمهای با قرابت نزدیک، بخصوص وقتی دادههای مرفولوژیکی کمک کننده یا به قدر کافی متمایزکننده نبوده، به کار گرفته شده است
در این مطالعات نوعاً دادههای توالی DNA،و عمدتاً توالی نواحی ITS، به عنوان اساسی برای شناسایی شریک قارچی میکوریزا مورد استفاده قرار گرفته است. در تحقیق حاضر نیز استفاده از توالی ناحیه بعنوان ابزاری دقیق و ارزشمند جهت شناسایی قارچهای میکوریز در عرصههای جنگلی ایران مورد تایید قرار گرفت.
