بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه: Acinetobacter baumannii یک پاتوژن فرصتطلب مهم است که بهعنوان عامل تعداد زیادي از عفونتهاي بیمارستانی شناخته میشود. تمایل گونههاي بیمارستانی به تولید بیوفیلم و ارتباط بیوفیلم با عفونتزایی و مقاومت این باکتري به طیف وسیعی از آنتیبیوتیکها، بهخوبی شناخته شده است.
هدف: مطالعهي حاضر، بهمنظور غلبه بر تهدیدات ناشی از این پاتوژن با استفاده از زیر واحد 371 اسید آمینهاي از دومینهاي عملکردي و حفظ شده از یک پروتئین سطحی دخیل در تولید بیوفیلم، براي ایجاد ایمنی، طراحی شده است.
روش و نتیجه: ژنوم باکتري به روش لیز قلیایی تخلیص شد و با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی، قطعهي مورد نظر از طریق واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR - فراوان سازي شد. محصول PCR بعد از هضم آنزیمی، بر روي پلاسمید pET28a همسانه سازي گردید.
پروتئین تولید شده به وسیلهي SDS-PAGE بررسی و سپس به وسیلهي کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص شد. در ادامه ي پژوهش موشهاي BALB/c، در سه نوبت با پروتئین نوترکیب خالص به صورت زیرپوستی ایمن شدند. موشهاي ایمن و غیرایمن، هفت روز پس از آخرین یادآوري، با سوش بیمارستانی آلوده شدند. تعداد معنی داري از موشهاي ایمن، زنده ماندند درحالیکه هیچ یک از موشهاي غیرایمن تا 24 ساعت بعد از تزریق باکتري، زنده نماندند. مقایسهي میزان بقا حیوانات ایمن با گروه کنترل، بیانگر نقش حفاظتی موأثر این ایمنیزایی است.
-1 مقدمه
A. baumannii یک عامل بیماریزاي بیمارستانی و عامل بسیاري از عفونتهاي شدید مثل باکتریمی، پنومونی، مننژیت و عفونت هاي دستگاه ادراري و زخم میباشد
پروتئین غشاي خارجی - AbOmpA - به عنوان یک عامل بیماریزاي قوي شناخته شده است که باعث القاي مرگ برنامهریزي شدهي سلولی1در سلولهاي میزبان میشود. از دیگر عوامل بیماریزایی باکتري، تولید بیوفیلم است. بیوفیلمها جوامعی از باکتريها هستند که در پوششی ازمادهي زمینهاي به نام اگزوپلی ساکارید قرار گرفتهاند - . - 4 جنس مادهي زمینهاي خارج سلولی در بیوفیلم A. baumannii ، poly-β- - 1-6 - -N-acetylglucosamine - PNAG - است.
در تشکیل بیوفیلم، پروتئین وابسته به بیوفیلم - Bap - 2 نقش اساسی دارد. این پروتئین با داشتن یک هستهي مرکزي با توالیهاي تکراري و وزن مولکولی بالا در روند ایجاد عفونت نقش بهسزایی دارد. این پروتئین داراي 8620 اسیدآمینه و نقطهي ایزوالکتریک حدود 3 است
رهبر و همکاران با استفاده از نرم افزارهاي بیوانفورماتیکی، چهار ناحیهي حفاظت شده و عملکردي پروتئینBap را که قابلیتهاي ایمنیزایی بالایی دارند را مشخص نمودند - . - 5 در این پژوهش یک توالی 371 اسیدآمینهاي از پروتئینBap انتخاب شد و ژن مربوط به این قسمت پس از فراوان سازي در پلاسمید همسانهسازي شد. پروتئین نوترکیب، بیان و خالص شد و قدرت ایمنیزایی آن با تزریق به موش، مورد بررسی قرار گرفت.
-2 مواد و روش ها
-1-2 تکثیر ژن و ساخت سازواره
قطعهي ژنی مورد نظر با واکنش زنجیرهاي پلیمراز فراوان سازي شد. جهت تأیید محصول واکنش زنجیرهاي پلیمراز، از آنزیمهاي محدود کنندهي BclI وTaqI استفاده شد. پس از تایید صحت ژن تکثیر یافته، محصول PCR و پلاسمید pET28a به طور جداگانه توسط آنزیم هاي EcoRI و HindIII به مدت 10 ساعت در دماي 37 °C مورد هضم قرار گرفت. سپس واکنش الحاق در دماي 12 °C به مدت 16 ساعت انجام گرفت. محصول الحاق به داخل سلول هاي E. coli BL21DE3 که با استفاده از کلرید کلسیم، مستعد شده بودند، با روش شوك سرما-گرما تراریخت شد. در ادامه آنالیز اولیه کلونها به روش هضم آنزیمی صورت گرفت.
-2-2 بیان و تخلیص پروتئینهاي نوترکیب به کمک کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA
سلول E. coli BL21DE3 حاوي ژن Bap، درمحیطهاي LB مایع حاوي70 میکروگرم در میلیلیتر کانامایسین درشیکر انکوباتور با دماي37 °C و با 220 دور در دقیقه کشت داده شدند. پس از رسیدن جذب نوري به 0/6 درطول موج 600 نانومتر، IPTG با غلظت نهایی 1 میلیمولار در شرایط استریل اضافه شد و بهمدت 5 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد و با 220 دور در دقیقه در شیکر انکوباتور انکوبه شدند.در ادامه، پروتئین نوترکیب به روش دناتوره و با کمک کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص شد. به منظور تایید صحت ژن بیان شده از روش لکهگذاري نقطهاي و آنتیبادي ضد هیستیدین استفاده شد.
-3-2 ایمنسازي موشهاي آزمایشگاهی با محصول نوترکیب و چالش موشها با A. baumannii
مقدار 10 میکروگرم پروتئن نوترکیب به همراه ادجوانت فروند به 30 عدد موش BALB/c ،در سه نوبت با فاصلهي هر 2 هفته به صورت زیر پوستی تزریق شد. به موشهاي کنترل ادجوانت فروند و PBS تزریق شد. بهمنظور تأیید ایمنسازي موشها و همچنین مشاهدهي تیتر آنتیبادي در پی هر تزریق، سنجش الایزاي غیر مستقیم انجام شد.در ادامه براي مشخص کردن دز کشنده50 درصد، رقتهایی از 104 تا 108 باکتري به چهار گروه 5 تایی موش BALB/c به صورت صفاقی تزریق شد و تا 5 روز وضعیت مرگ و میر موشها بررسی شد. براي بررسی مقاومت موشهاي ایمن در برابر عفونت، رقتهاي از 108 تا 1013 باکتري، بهصورت صفاقی به گروههایی از موشهاي ایمن شده و کنترل تزریق شد.
-3 نتایج و بحث
اندازهي قطعات بهدست آمده از هضم آنزیمی محصوال PCR، با آنالیز نرمافزاري منطبق بوده و دلیلی بر احتمال صحت محصول واکنش زنجیرهایی پلیمراز میباشد
شکل ٣-١ : ھضم محصول واکنش زنجیرهای پلی مراز با آنزیم محدود کننده. ستون ١: نشانه اندازه ی مولکولی . DNA 100bp plus ستون ٢: محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز. ستون ٣: قطعات ایجاد شده ناشی از ھضم با آنزیم .
BclI ستون ۴ قطعات ایجاد شده ناشی از ھضم آنزیمی با آنزیم . TaqIقطعه ي تکثیر شده و پلاسمید مورد استفاده بهطور جداگانه با آنزیمهاي محدودکننده EcoR1 و HindIII هضم شدند. پس از تراریخت کردن محصول واکنش الحاقی، از کلونهاي به دست آمده عمل تخلیص پلاسمید به روش لیز قلیایی به عمل آمد. براي تأیید همسانههاي بهدست آمده، پلاسمیدهاي استخراج شده مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند.
-1-3 بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب
بعد از بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب Bap مشاهده شد که با وجود اینکه وزن مولکولی پروتئین 41 کیلودالتون است اما به دلیل اسیدیتهي پایین - نقطهي ایزوالکتریک : - 3 پروتئین، حرکت آن در طی الکتروفورز کند صورت میگیرد و باند مورد نظر بالاتر قرار میگیرد
با توجه به اینکه پروتئین اسیدي میباشد، SDS به آن متصل نمیشود لذا در طی عمل لکهگذاري وسترن، نمینواند از ژل به کاغذ نیتروسلولز منتقل شود بنابراین جهت تایید صحت پروتئین بیان شده از روش لکهگذاري نقطهاي استفاده شد
شکل ٣-٢ : بررسی تخلیص پروتئین نوترکیب Bap با ستون میل ترکیبی Ni-NTA روي ژل SDS-PAGE 10 ١٠%. ستون M ، نشانهی اندازه مولکولی پروتئین، ستون ھای F1 و F2، نمونهی خروجی ستون پس از بارگذاري محلول حاوي پروتئین نوترکیب. ستون C1، C2 و D، نمونهی ھای خروجی ستون پس از شستشو با بافر ھای شستشو دھنده. ستون ھای E1 و E2 نمونه ھای خروجی پس از فروشویی با بافر E
شکل ٣-٣ : دات بلاتینگ پروتئین نوترکیب Bap با آنتی His ١: پروتئین-ھای سلول E. coli BL21DE3 لیز شده حاوی ژن Bap القا شده با IPTG ٢: پروتئین نوترکیب بعد از تخلیص.٣: پروتئین-ھای سلول لیز شده حاوی ژن Bap القا نشده.
