بخشی از مقاله
چكيده
گياهاني كه ريشه آنها توسط قارچهاي ميكوريز آربوسكوالر كلونيزه ميشوند٬ بطور معمول نسبت به تنشهاي مختلف از قبيل شوري تحمل باالتري دارند، بنابراين جداسازي و شناسايي اين قارچها مي تواند جهت توليد كودهاي بيولوژيك براي مناطق مذكور بسيار مفيد باشد. بدين منظور پس از نمونه برداري ريشه و اسپور از ريزوسفر گياهان مورد مطالعه - گندم، جو و برخي از علفهاي هرز - از خاكهاي شور استانهاي يزد، آذربايجان شرقي، قم و مركزي، كل ژنوم گياه و ريزوسفر با روش PCR آشيانه اي دو مرحله اي براي حضور قارچهاي ميكوريز مورد بررسي قرار گرفت.
در مرحله اول PCR از آغازگرهاي اختصاصي قارچهاي ميكوريزي - LSU-Glom1 and SSU-Glom1 - و پس از هضم آنزيمي با Alu1، در مرحله دوم PCR از آغازگرهاي عمومي قارچها ITS5 - و - ITS4 استفاده شد. محصوالت مرحله دوم PCR هر نمونه، همسانه سازي و كلنيهاي مثبت با آنزيم برشي Taq1 هضم شدند. با مقايسه الگوهاي RFLP نمونههاي هضم شده و توالييابي نماينده هايي از هر الگوي برشي، وجود جنسهاي Glomus و Acaulospora در ريزوسفر نمونهها مشخص شد.
جنس Glomus غالبترين جنس - بيش از 09 درصد - و گونههاي 09 - Glomus mosseae % - ، G. intraradices ، G. versiforme، G. sinuosum٬ G. fulvum، G. constrictum و Glomus sp در جنس مذكور مشاهده شدند. بيشترين تنوع گونه اي در خاكهاي يزد و در گياه گندم مشاهده شد. نتايج نشان داد كه گونه G. mosseae داراي باالترين سازگاري به شرايط شور در مناطق مختلف كشور مي باشد و لذا ميتواند پس از انجام آزمايشات تكميلي به عنوان كود بيولوژيك در اين مناطق استفاده شود.
مقدمه
شوري خاك يكي از مهمترين مشكالت كشاورزي در سطح دنيا بوده و بطور مداوم در مناطق مختلف دنيا در حال گسترش است - Giri et al., 2003; Al-Karaki, 2006 - و با توجه به اينكه ايران در منطقه خشك و نيمه خشك واقع شده است، درصد بااليي از مناطق كشور حاوي خاكهاي شور ميباشند. يكي از روشهاي مقابله با شوري كه در چند سال اخير مورد استفاده قرار گرفته است٬ استفاده از ميكروارگانيسمهاي همزيست نظير قارچها و باكتريها در مقابله با تنش شوري در خاك است.
ميكوريزا - قارچ- ريشه - ٬ همزيستي بين قارچ و گياه مي باشد كه ميكوريزا آربوسكوالر، رايجترين نوع همزيستي مسالمتآميز بين ميكروارگانيسمهاي خاكزي و گياهان است كه اهميت اكولوژيك و اقتصادي فراواني دارد. اين قارچهاتقريباً 0 تا 63 درصد زيست توده خاك و 0 تا 00 درصد زيست توده ميكروارگانيسمهاي خاك را در اراضي كشاورزي شامل ميشوند .
مطالعات زيادي در زمينه نقش قارچهاي ميكوريزي در محافظت گياه عليه استرس شوري انجام شده است و مشخص گرديده كه رابطه همزيستي اين نوع قارچها٬معموالً در نتيجه افزايش در جذب مواد غذايي - Al-Karaki and Clark, 1998 - ، افزايش ضريب فتوسنتزي و افزايش راندمان آب قابل استفاده توسط گياه ميباشد - Jahromi et al., 2008; .Graham et al.,1987; Tavasolee et al., 2011 - در سالهاي قبل براي شناسايي قارچهاي ميكوريزي تنها از روش مورفولوژي اسپورها استفاده مي شد et al., 2005 - . - Aliagharzad, 1379; Kariman
در غياب اسپورها، ساختارهاي درون ريشه اي قارچها در بهترين حالت فقط شناسايي در حد خانواده را ممكن ميساخت . - Merryweather & fitter 1998 - در چند سال اخير با پيشرفت روشهاي مولكولي٬ امكان تكثير اختصاصي٬ تهيه نقشههاي RFLP و توالي يابي قطعات خاصي از ژنوم اين نوع قارچ به وجود آمده است. يك الگوي RFLP پس از ثبت شدن ميتواند براي مقايسه با توالي هاي جديد، بدون نياز به توالي يابي مجدد بكار رود .
- Redecker et al., 2003 - عالوه براين در چند سال گذشته با استفاده از يك جفت آغازگر اختصاصي LSU-Glom1 - و - SSU-Glom1 در تركيب با جفت آغازگرهاي عمومي قارچي ITS4/ITS5 و با استفاده از روش PCR آشيانهاي٬ امكان شناسايي اين نوع قارچها بوجود آمده است . - Renker et al., 2003 - تحقيق حاضر به عنوان اولين تحقيق مولكولي در راه شناسايي قارچهاي ميكوريز در شرايط تحت تنش شوري در كشور با استفاده از روشهاي مولكولي و معرفي سويههاي متحمل به تنش خشكي براي استفاده از آنها به عنوان كود بيولوژيك در شرايط تنشهاي شوري انجام گرديد.
مواد و روشها نمونه برداري از خاکهاي زراعي مناطق شور و استخراج اسپور در ماههاي اريبهشت و خرداد ٬ تعداد 816 نمونه از ريشه و خاك ريزوسفر گياهان گندم٬ جو و علفهاي هرز موجود در مزارع مذكور از قبيل شيرين بيان٬ تلخ بيان٬ يوالف وحشي٬ سلمك - سلمه تره - ٬ چچم و خارشتر در مناطق مختلف تحت تنش شوري استانهاي مركزي، يزد، قم و آذربايجان شرقي با ميزان EC بين 1 تا 81 جمعآوري شد. از هر نمونه خاك سه نمونه 199 گرمي انتخاب و با استفاده از روشهاي Gerdemann و - 8036 - Nicolson و - 8034 - Jenkis اسپور قارچهاي ميكوريزا آربوسكوالر جداسازي شدند.
شناسايي مورفولوژيك قارچهاي ميكوريز آربوسكوالر و تنوع آنها در خاکهاي مناطق شور مورد مطالعه براي بررسي خصوصيات مورفولوژيك و مورفومتري اسپورها از ميكروسكپ نوري - - Nikon Eclipse E800 استفاده گرديد. براي تعيين اندازه اسپورها، 69-39 اسپور از هر گونه، اندازهگيري گرديدند. شناسايي دقيق گونهها با استفاده از اطالعات ارائه شده در سايتهاي اينترنتي INVAM و Blaszkowski، و كتاب راهنماي شناسايي قارچهاي ميكوريز آربوسكوالر - Schenck & Perez,1990 - انجام گرديد.
استخراج DNA از ريشه و واكنش زنجيرهاي پليمراز آشيانهاي1 استخراج DNA ريشهها - حاوي ژنوم گياه و فلور ميكروبي در داخل و خارج آن - با استفاده از روشهاي a, - Redecker - 1999b صورت پذيرفت. واكنش زنجيرهاي پليمراز به صورت آشيانهاي براي جلوگيري از تكثير آلودگيهاي جانبي، كاهش اثر مواد بازدارنده و اختصاصيتر كردن واكنش بر اساس روش Renker و همكاران - 1996 - با انجام تغييراتي در دستگاه ترموسايكلر iCYCLER - Bio Rad - انجام شد.
جفت آغازگرهاي اختصاصي قارچهاي ميكوريزا آربوسكوالر شامل LSU Glom1 و SSU Glom1 در مرحله اول و جفت آغازگرهاي عمومي براي قارچها شامل ITS4 و ITS5 در مرحله دوم PCR به منظور تكثير قطعه ITS استفاده شدند. محصول PCR هضم شده در مرحله دوم واكنش PCR استفاده شد. در اين مرحله واكنش PCR با حجم كل 09 ميكروليتر مطابق با مرحله اول PCR با آغازگرهاي ITS5 و ITS4 انجام پذيرفت.. براي هر نمونه، محصول PCR با قويترين باند روي ژل و طول قطعه ITS مورد نظر براي قارچ هاي ميكوريز آربوسكوالر - 099-309bp - انتخاب و با استفاده از دستورالعمل كيت خالص سازي PCR - Fermentas - خالص سازي شد.
تهيه نقشه برشي و توالي يابي محصوالت PCR
به منظور بررسي نقشه برشي محصوالت PCR٬ 7 ميكروليتر از هر كدام از محصوالت PCR بدست آمده با استفاده از 0 واحد آنزيم - Fermentas - Taq1 در دماي30°C به مدت 8 ساعت برش داده شدند و بر روي ژل آگاروز 1 درصد جريان داده شدند. كلونينگ محصوالت PCR انتخاب شده بر اساس نقشه برشي به داخل وكتور pTZ بر اساس پروتكل كارخانه TOPO TA Cloning Kit - Invitrogen Life - همسانه و درون باكتري اشرشياكلي XL1blue ترانسفورم گرديد. قطعات كلون شده سپس براي توالي يابي ارسال گرديد.
تفسير نتايج و تشكيل دندروگرام
تواليهاي بدست آمده با استفاده ازBLASTN كنترل و نزديكترين توالي به آنها به عنوان توالي مرجع انتخاب شد. تواليهاي بدست آمده و مرجع با كمك برنامه ClustalX صف بندي و سپس در برنامه BioEdit نسخه7 /9/0 تنظيم گرديد. روابط فيلوژنتيك با استفاده از مدل Kimura-2 – parameterبا الگوريتم نزديكترين همسايه - Neighbor - Saitou & Nei,1987 - Joining - NJ - algorithm - با كمك - Tamura et al., 2007 - MEGA4 ترسيم و تفسير گرديد.
نتايج و بحث
در اين تحقيق جداسازي و شناسايي قارچهاي ميكوريز آربوسكوالر غالب در خاك هاي شور زراعي با ميزان EC بين 1 تا 81 برخي مناطق كشور شامل استانهاي مركزي، يزد، قم و آذربايجان شرقي صورت پذيرفت. تعداد 816 نمونه از مناطق مختلف اشاره شده از مزارع گندم٬ جو و علف هاي هرز جمعآوري و سپس براي جداسازي اسپور قارچهاي مذكور و همچنين استخراج DNAي ژنومي از ريشه و ريزوسفر استفاده شدند.
مطالعه مورفولوژي و مورفومتري اسپورها در مخلوط PVLG و ملزر - 8:8 - با ميكروسكوپ نوري نشان داد كه گونههاي متعلق به دو جنس ميكوريز آربوسكوالر شامل Glomus و Acaulospora در ريزوسفر گياهان مورد مطالعه وجود دارند. بيش از 09 درصد گونهها متعلق به جنس Glomus و 89 درصد بقيه متعلق به جنس Acaulospora بودند كه به ترتيب به خانواده هاي گلومراسه - راسته گلومرال - و آكولوسپوراسه - راسته آكولوسپورا - تعلق دارند - شكل . - 8 نكته قابل توجه اينكه مطالعات شناسايي مورفولوژيك نشان داد كه حدود %09 اسپورهاي جداسازي شده جنس Glomus مشاهده شده در نمونهها از گونه G. mosseae بودند و گونه G. intraradices نيز به ميزان حدود 19 درصد در رتبه دوم قرار داشت.
همچنين مطالعات مورفولوژيك حضور گونه G. sinuosum را مشخص نمود - حدود 0 درصد - ٬ اما حدود 10 درصد نيز به عنوان Glomus sp. در حد جنس شناسايي شدند - شكل . - 8 پس از انجام دو مرحله واكنش زنجيرهاي پليمراز آشيانهاي - شكل - 1 براي DNAي استخراج شده از نمونهها، و خالصسازي محصوات PCR٬ نقشهRFLP بيش از 819 محصول PCR با آنزيم برشي Taq1 تهيه گرديد - شكل - 6 و نماينده هاي هر الگو، پس از كلونينگ٬ توالييابي گرديدند . حدود 899 توالي محصول PCR و RFLP توالييابي گرديد.
