بخشی از مقاله
چکیده:
روشهاي بیوشیمیایی بیشماري جهت شناسایی گونه در دهههاي گذشته به کار رفتهاست . ظهور تکنیکهاي ملکولی انقلاب بزرگی در شناسایی گونه به وجود آورد با گسترش واکنشهاي زنجیرهاي پلیمراز ، حرکت به سوي دستیابی به روشی با قابلیت تکرارپذیري بالا وسهولت بیشتر در مقایسه با روشهاي بیوشیمی سبب شد تا تکنیکهاي ملکولی مختلفی جهت شناسایی گونه مورد استفاده قرار گیرد .
در این میان تکنیک-PCR RFLPبه عنوان روشی مناسب جهت شناسایی گونه هاي حیوانات مختلف به کار گرفته شده است . استفاده از mtDNAبه دلیل فراوانی ونرخ جهش بالا در بیشتر مطالعات شناسایی گونه به عنوان نشانگر ملکولی به کار گرفته شده است بااستفاده از mtDNA به علت تغییرات ژنومی کمتر در طول زمان و تکثیر ناحیه سیتوکروم b و استفاده از ژل آگارز و درنهایت استفاده از تکنیک PCR-RFLP و آنزیم BshnI تشخیص نژاد گوسفند از سایر نژادها و همچنین گوسفند اهلی از گوسفندان وحشی ایران انجام شد.
باتکثیر نواحی فوق توسط پرایمرهاي اختصاصی تشخیص جنس و همچنین تشخیص گوسفند از سایر گونه ها حاصل شد، همچنین با هضم آنزیمی در نژاد اهلی برش ایجاد نشد اما در نژادهاي وحشی برش ایجادشد و دو قطعه 228 و301 جفت بازي ایجاد نمود. توسط این تکنیک می توان گونه را از همدیگر تشخیص داد وهم در زمینه صنعت گوشت و هم در زمینه محیط زیست کمک شایان توجهی نمود.
مقدمه:
تا کنون کار پژوهشی براي شناسایی گونه هاي گوسفندوحشی ایران ازروي بقایاي بیولوژیک به جاي مانده از آنها انجام نشده است. مقایسه و تجزیه و تحلیل - mtDNA - بعلت عدم نوترکیبی، توارث مادري، درجه بالایی از تغییرات بین گونه اي و نیز تعداد زیادي از کپی هاي موجود آن در سلول در مقایسه با DNA موجود درهسته روشی مناسب براي شناسایی گونه ها است. - 5،4،3،2، - 1
مواد و روشها:
.1نمونه گیري:براي نژاد اوریال از - پارك ملی گلستان، پارك ملی قرخود - ، نژاد ارمنی - انگوران زنجان،ارسباران - ،نژاد البرز مرکزي - مناطق حفاظت شده ورجین و سرخه حصار تهران، - ، نژاد لارستانی - لارستان فارس - ، نژاد اصفهانی - مناطق حفاظت شده قمیشلو و کلاه قاضی اصفهان - نمونه هاي سرگین ،از هر منطقه 20 تا 40 نمونه و براي گوسفندان اهلی که در این مناطق زندگی می کردند - زل،قره گل،تالشی،کبوده شیراز،افشاري،سنجابی،مغانی،زندي،ماکویی و... - از هر نژاد 20 نمونه خون گرفته شد.
توالی سیتوکروم - mtDNA - b از سایت - http://www.ncbi.com/ - NCBI گرفته و توسط نرم افزار Vector NTI میزان تطابق بررسی و پرایمرها بصورت اختصاصی براي گوسفندطراحی شد و اختصاصی بودن آنها توسط Blast علیه سایر توالیهاي موجود ارزیابی شد . جهت استخراج DNA از - Roach - High Pure PCR Template Preparation Kit استفاده شد. جهت تعیین کیفیت و کمیت DNA از روشهاي الکتروفورز با ژل آگارز و اسپکتوفتومتري استفاده شد.
براي تکثیرنواحی هدف توالی میتوکندري واکنش زنجیره اي پلیمراز پس از واسرشته سازي اولیه در 94 درجه در مدت5دقیقه با 30 چرخه و تحت رژیم حرارتی زیر انجام گردید: واسرشته نمودن94درجه به مدت 60 ثانیه، اتصال آغازگرها 60درجه به مدت 60 ثانیه و تکثیر توالی موردنظر 72درجه به مدت 60 ثانیه . همچنین پس از 30 سیکل دماي 72 درجه به مدت 5 دقیقه جهت تکثیر قطعاتی که موفق به تکثیر نشده اند،انجام گرفت.
واکنش زنجیره اي پلیمراز در حجم هاي 50 میکرولیتري - بافر یک برابرPCR ،2 میلی مولار Mgcl2 ،0/2 میلی مولاراز هر dNTP ،10میکرومول از هر آغازگر، و2واحد - Taq DNA Polymeraseشرکت سیناژن - بهمراه 50 نانوگرم DNA استخراج شده - صورت گرفت.جهت تشخیص محصولات PCR از ژل آگارز%1/5 با رنگ آمیزي اتیدیوم برماید استفاده گردید.محصولات PCR توسط آنزیم آندونوکلئاز BshNI - ‹BanI› Fermentaz - انجام شد.پس از آن با استفاده از ژل %1.5آگارزمحصولات برشی بررسی نمودیم.
نتایج وبحث:
نمونه هاي DNA استخراج شده از سرگین پس از انجامPCR باندهاي خیلی ضعیف و کمرنگی ایجاد نمود که بر روي ژل آگارز دیده نمی شد ویا بسختی دیده می شد، لذا با نتیجه گیري مبنی بر این که مقدار DNA سرگین خیلی کم است ما، دوPCR متوالی در دو مکان فیزیکی جداگانه و با استفاده از سمپلر جداگانه و رعایت سایرموارد براي عدم آلودگی نمونه ها انجام دادیم و در PCR ثانویه به جايDNA از محصولات PCR اولیه استفاده نموده و پس ازآن باندهاي مورد نظر مشاهده شد.آغازگرهاي طراحی شده جهت تشخیص گونه گوسفند - اهلی و وحشی - از سایر گونه ها بوده که مربوط به ناحیه اي از ژنوم سیتوکروم b میتوکندري بوده که طول آن529جفت باز می باشد.
جهت اطمینان از اختصاصی بودن دو آغازگر فوق ، با نمونه هاي DNA سایر گونه هاي نزدیک به گوسفند - بز ،گاو ،خوك - PCR انجام داده و هیچ باندي دیده نشد و این به منزله اختصاصی بودن آغازگرهاي فوق بوده و می توان با اطمینان زیاد از نتایج بدست آمده در تصمیم گیري هاي مختلف در سازمان محیط زیست ، دامپزشکی و مجامع قضایی و همچنین اتخاذ تصمیم گیري هاي مناسب در سایر بخش هاي مربوطه استفاده نمود.
نتایج با نتایج توب و همکاران - - 2008 که 18 گونه پستاندار اروپایی را با استفاده از ژنوم cyt b شناسایی کردند مشابه بودو با نتایج مینارویک و همکاران - - 2010 که کار مشابه اي در زمینه تشخیص گونه انجام داده اند سازگار بود.عمل هضم آنزیمی در 40 نمونه اهلی 30 نمونه وحشی انجام شد و نتیجتاًدر هیچ کدام نمونهاز هاي اهلی برش انجام نشد اما در تمام نژادهاي وحشی برش انجام شد و 2 قطعه 301 و 228 جفت بازي ایجاد نمود.
