بخشی از مقاله
چکیده
ویژگیهای منحصر به فرد زیستحسگرها چون حساسیت، دقت باال، ارزان قیمت بودن، عدم نیاز به تجهیزات و آزمایشگاههای پیشرفته و شناسایی چندین ماده به طور همزمان آنها را به مناسبترین و پرکاربردترین ابزار شناسایی تبدیل کرده است. آفالتوکسینها متابولیت-های سمی و سرطانزای تولید شده توسط قارچهای آسپرژیلوس میباشند، که با آلوده کردن مواد غذایی اثرات سو خود را بر روی سالمت موجودات و کیفیت مواد غذایی القا مینمایند.
هدف از این پژوهش طراحی و ساخت یک زیستحسگر الکتروشیمیایی شناساگر آفالتوکسینb1 مبتنی بر آنزیم استیل کولین استراز میباشد. در این پژوهش ابتدا آنزیم توسط پلی ونیل الکل از طریق به دام اندازی بر روی سطح الکترود کربن شیشه تثبیت گردید.
سپس به منظور حفظ فعالیت بیولوژیکی آنزیم، تسهیل انتقال الکترون و افزیش پایداری کیتوسان و نانو لولههای کربنی به کامپوزیت مذکور افزوده گردید. حد تشخییص بیوپروب مذکور 1 نانوموالر است و قادر به تولید 19 میکروآمپر جریان در حضور سوبسترا میباشد. عالوه براین بیوپروب طراحی شده دارای پایداری و دقت بسیار خوبی است، بنابراین میتواند در آینده نزدیک برای ساخت زیستحسگر مورد استفاده قرار گیرد.
.1 مقدمه
مایکوتوکسینها متابولیتهای ثانویه تولید شده توسط قارچها میباشند، که با آلوده نمودن مواد غذایی مورد مصرف انسان و دام، سبب ایجاد طیف وسیعی از عوارض جانبی و اثرات سمی در موجودات میگردند .>1@ به گونهای که
مصرف این متابولیتهای سمی، سبب ایجاد بیماری مایکوتوکسیوز در انسانها و حیوانات میشود .>2@ آفالتوکسینها یک گروه از اعضای خانواده مایکوتوکسینها هستند، که ساالنه بیش از 25 ازموادغذایی مورد مصرف موجودات را در سراسر جهان آلوده مینمایند. این توکسینها توسط برخی از گونههای آسپرژیلوس به ویژه آسپرژیلوس فالووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس تولید میشوند.
این ترکیبات عالوه بر اثرات جهشزایی و سرطانزایی، عامل سرکوب کننده سیستم ایمنی می-باشند و سبب بروز اختالالتی از قبیل هپاتیت، سرطان کبد و سندرم Reyeʼs میشوند. مواجههی مستقیم با آفالتوکسینها عالوه بر اثرات سوء ایمنی، منجر به اختالل در متابولیسم پروتئینها و ریزمغذیهای مختلف میشود 5[،4،3 و.]6 بنابراین مصرف طوالنی مدت این توکسین، حتی در غلظت بسیار پایین، بسیار خطرناک است، به گونهای که درسال 1993آژانس بین المللی تحقیقات سرطان آفالتوکسینهای B1, B2,G1,G2 را درگروه 1 مواد سرطانزا قرار داد. الزم به ذکر است که آفالتوکسین B1 دارای بیشترین اثر سرطانزایی است
روشهای گوناگونی همچون کروماتوگرافی، االیزا، فلورسانس، طیف سنجی و جذب ماورابنفش برای شناسایی آفالتوکسین وجود دارد. این روشها در عین داشتن دقت و حساسیت باال، دارای معایبی چون زمانبر بودن، نیاز به آماده سازی نمونه، نیاز به پرسنل آموزش دیده، تجهیزات گران قیمت و آزمایشگاههای پیشرفته میباشند 8[ و.]9 بنابراین در این پژوهش از زیست حسگرها با نداشتن معایب فوق استفاده شد.
استیل کولین استراز آنزیمی ضروری و حیاتی در سیستم عصبی مرکزی موجودات زنده میباشد. این آنزیم منجر به توقف انتقال پیام عصبی در سیناپسهای کولینرژیک سیستم عصبی پستانداران میشود. آفالتوکسین b1 سبب مهاربرگشت پذیر و غیر رقابتی آنزیم مذکور می گردد
از این خاصیت در طراحی زیست حسگرها میتوان استفاده نمود، به صوررتی که حسگرهای زیستی مبتنی بر آنزیم استیل کولین استراز به عنوان جایگزین مناسبی نسبت به روشهای قدیمی در نظر گرفته میشوند. اندازه کوچک، دقت، حساسیت و واکنش سریع حسگرهای زیستی مبنی بر آنزیم استیل کولین استراز نتایج رضایت بخشی برای آنالیز نشان میدهد و در آنها فعالیت آنزیم به عنوان شاخصی برای سنجش کمی مواد به کار میرود
در سال Hansmman 2009 و همکارانش یک بیوسنسور آمپرومتری شناساگر آفالتوکسین مبنی بر آنزیم استیل کولین استراز ارائه کردند. در این روش ابتدا سطح الکترود چاپی با کبالت فتالوسیانین اصالح گردید سپس 3 میکرولیتر از مخلوط همگن آنزیم با پلی ونیل الکل بر سطح الکترود تثبیت شد. سپس به منظور فتوپلیمریزاسیون الکترود به مدت 3 ساعت زیر المپ نئون قرار گرفت و حد تشخیص در این روش 1 ppm گزارش گردید
هدف از انجام پژوهش حاضر، تثبیت آنزیم استیل کولین استراز با استفاده از پلی ونیل الکل، کیتوسان و نانو لولههای کربنی بر سطح الکترود کربن شیشه به منظور تولید بیوپروب کارا برای ساخت بیوسنسور الکتروشیمیایی ولتامتری چرخهای با دقت، حساسیت و پایداری طوالنی مدت بود، به گونهای که توانایی تشخیص کمترین غلظت آفالتوکسین را داشته باشد.
.2 مواد و روشها
2-1 مواد
آفالتوکسین b1، آنزیم استیل کولین استراز 500 u.mg از گونه Electrophorus electricus ، استیل کولین یداید MW - 298.2 g/mol - ، معرف المن، کیتوسان، پلی ونیل الکل، نانولولههای کربنی چند جداره از شرکت سیگما آلدریچ آلمان خریداری شد. پتاسیم کلراید، اسید استیک، اتانول و نمکهای الزم جهت تهیه بافر فسفات از شرکت مرک و الکترود کربن شیشه از شرکت آذر الکترود خریداری گردید.
2-2 روشها
2-2-1 سنجش فعالیت آنزیم
فعالیت آنزیم استیل کولین استراز توسط روش رنگ سنجی المن تایید گردید. سپس این آزمایش در حضور آفالتوکسین b1 انجام شد و مهار آنزیم توسط این توکسین مشاهده گردید.
