بخشی از مقاله
چکیده
آنزیمهاي گلوکاناز در موجودات مختلف، مثل باکتريها، گیاهان، قارچها و مهرهداران وجود دارند. تاکنون انواع مختلفی از آنزیمهاي بتا-1،-3گلوکاناز در گونههاي مختلف جنس تریکودرما تخلیص و بررسی شدهاند که یکی از آنها Bgn13.1 میباشد. بررسی 30 جدایه قارچ تریکودرما که اثراًک از مناطق مختلفی ران جمع آوري شده بودند، نشان داده بود، سویههاي مختلف گونه هاي Trichoderma virens، T. parceramosum، T. harzianum، T. atroviridae و T. viridae داراي بیشترین توان تولید این آنزیمهاي بتا-3،-1گلوکاناز میباشند.
طی آزمایشهاي انجام شده براي جداسازي ژن bgn13.1 از این جدایهها، توالی مورد انتظار این ژن از گونه T. virens تکثیر گردید و نهاتاًی cDNA ژن bgn13.1 این گونه جهت ساخت سازه بیانی پروکاریوتی استفاده شد. همسانه سازي ژن bgn13.1 در ناقل pET26b - + - به صورتی انجام گرفت که cDNA این ژن بلافاصله بعد از توالی راهنماي پپتیدي pelB قرار گرفته به طوري که چارچوب بیانی ژن حفظ شد.
این توالی راهنما باعث ترشح پروتئین نوترکیب در پریپلاسم باکتري می گردد. همچنین در انتهاي ژن، رمز خاتمه ترجمه ژن bgn13.1 حذف شده و بلافاصله بعد از آخرین نوکلئوتید قبل از رمز خاتمه ژن، یک توالی رمز کننده شش هیستیدین به صورت دنباله در انتهاي پروتئین قرار گرفت که پس از بیان در سویه BL21 - DE3 - pLysS باکتري E. coli، خالص سازي پروتئین نوترکیب را با ستون His-Tag ممکن میسازد.
مقدمه
آنزیمهایی که پیوندهاي بتا-1،-3گلیکوزیدیک را تجزیه میکنند در انواع قارچها Martin - و همکاران 2007، Kusama و همکاران - 1986، باکتريها Bielecki - و - 1991 Galas، جلبکها Duncan - و همکاران - 1956، نرمتنان Cutler - و - 1979 Yellowlees و گیاهان عالی Rousseau-Limouzin - و - 1991 Fritig دیده شده اند.
گلوکانازهاي متعددي مثل بتا-1،-6گلوکاناز و بتا-1،-3گلوکاناز توسط قارچها خصوصاً قارچ تریکودرما تولید میشوند - Martin و همکاران 2007، Elad و همکاران 1982، De la Cruz و 1999 Llobell،El-Katatny و همکاران . - 2001 بتا-گلوکانازهاي قارچی داراي ویژگیهاي فیزیکو شیمیایی متفاوتی هستند. وزن مولکولی اکثر این آنزیمها بین 20 تا 80 کیلو دالتون متغیر است.
pI این آنزیمها بین 4 تا 8 بوده و بهترین pH براي فعالیت این آنزیم ها بین 4 تا 6 می باشد. در این زمینه استثناهایی وجود دارد به طوري که بعضی از بتا-گلوکانازها در pH بالاتر از 7 و برخی دیگر در pH بین 2 و 3 فعالیت میکنند . همچنین دماي مناسب براي پایداري این آنزیمها بین 50 تا 60 درجه سلسیوس میباشد
با وجود اینکه تاکنون انواع مختلفی از آنزیمهاي بتا-3،1 -گلوکاناز در گونههاي مختلف جنس تریکودرما تخلیص و بررسی شده اند، بررسی خصوصیات ژنهاي بیان کننده این آنزیمها تنها محدود به چند ژن بوده است. در قارچ تریکودرما یک نوع آنزیم اندو-بتا-1،-3گلوکانازشناسایی شده است که احتمالاً به طور اختصاصی باعث فعالیت ضد قارچی این قارچ میگردد.
این پروتئین که تحت عنوان Bgn13.1 تخلیص و نامگذاري شده است، داراي وزن مولکولی 78kDa و pI=7/3 است. در ساختمان این پروتئین سه ناحیه قابل تشخیص است؛ یک توالی N-terminal leader با 34 اسید آمینه، یک ناحیه با توالی مشخص نشده و یک ناحیه غنی از سیستئین در انتهاي C-terminalه کاحتمالاًٌ درکنشوا این پروتئین با سایر ترکیبات دیواره سلولی دخالت دارد
پژوهشهاي انجام شده و بررسی فعالیت آنزیمهاي گلوکاناز 30 جدایه قارچ تریکودرما که اثراًک از مناطق مختلفی ران جمع آوري شده بودند، نشان داد سویههاي مختلف T. virens، T. parceramosum، T. harzianum، T. atroviridae و T. viridae داراي بیشترین توان تولید این آنزیمهاي بتا-1،-3گلوکاناز میباشند - بهرامسري . - 1382 طی آزمایشهاي انجام شده براي جداسازي ژن bgn13.1 از این جدایهها، توالی مورد انتظار این ژن از گونه Trichoderma virens تکثیر گردید
با توجه به این نتایج، نهاتاًی cDNA ژن bgn13.1 از گونه T. virens به عنوان کاندید جهت ساخت سازه بیانی پروکاریوتی جهت بررسی خصوصیات این پروتئین انتخاب شد. وزن مولکولی پروتئین حاصل از بیان این ژن حدود 81 کیلو دالتون، نقطه ایزوالکتریک آن 6/79 و در pH هفت بار منفی اندکی دارد. این ژن همچنین به گیاه سیب زمینی نیز منتقل شده است
مواد و روش ها
قارچها و ریزسازوارههاي مورد استفاده در این تحقیق
گونه Trichoderma virens به عنوان منبع cDNA ژن bgn13.1 استفاده شد. از سویه DH5α باکتري Escherichia coli نیز جهت تکثیر و نگهداري سازه هاي این تحقیق استفاده شد.
ناقل مورد استفاده
ناقل pET-26b - + - یکی از ناقلهاي شرکت Novagen است که به منظور بیان ژن 1 در میزبانهاي پروکاریوتی مثل سویه هاي خاص باکتري E. coli استفاده میشود و در این تحقیق از این ناقل براي بیان ژن گلوکاناز bgn13.1 در سویه BL21 - DE3 - pLysS باکتري E. coli استفاده شده است. این ناقل واجد ژن ایجاد مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین می باشد. ناحیه بیانی ناقل pET-26b - + - داراي یک توالی راهنماي 2 N-terminal pelB میباشد که براي ترشح پريپلاسمی پروتئین نوترکیب به کار میرود. این ناقل همچنین واجد توالی C-terminal His•Tag میباشد که براي خالص سازي پروتئین نوترکیب قابل استفاده است.
آغازگرها و شرایط واکنش PCR
براي همسانه سازي ژن bgn13.1 از آغازگرهاي FGlupETBP و RGlupETXI استفاده شد. با توجه به اینکه آغازگر 10 FGlupETBP نوکلئوتید در انتهاي 5′ خود دارد که با توالی ژن bgn13.1 مشابهت ندارد، عدم تکثیر قطعات دیگري با نرم افزار Oligo5 بررسی شد. براي تعیین بهترین شرایط تکثیر این ژن با آغازگرهاي طراحی شده، شرایط مختلف از جمله دماهاي مختلف annealing بررسی گردید و چندین PCR که تمامی شرایط آنها یکسان بوده و فقط دماي annealing آنها متفاوت بود، انجام شد.
بر اساس مجموعه واکنش هاي PCRهاي انجام شده نهایتاً شرایط95 درجه سلسیوس واسرشتی اولیه به مدت 4 دقیقه، 5 چرخه 94 درجه سلسیوس 60 ثانیه، 60 درجه سلسیوس 60 ثانیه، 72 درجه سلسیوس 150 ثانیه، 5 چرخه 94 درجه سلسیوس 60 ثانیه، 64 درجه سلسیوس 60 ثانیه، 72 درجه سلسیوس 150 ثانیه، 25 چرخه 94 درجه سلسیوس 60 ثانیه، 66 درجه سلسیوس 60 ثانیه، 72 درجه سلسیوس 150ثانیه و نهایتاً10 دقیقه 72 درجه سلسیوس براي تکثیر و همسانه سازي این ژن استفاده شد.
براي تایید همسانه سازي از آغازگرهاي Fbgn13.1 - F - ، Rbgn13.1 - R - ، T7 PP و T7 TP استفاده گردید - جدول . - 1
جدول -1 آغازگرهاي مورد استفاده در این تحقیق
نتایج
ساخت سازه بیانی ژن bgn13.1 در ناقل pET-26b - + - با نام pETKE2
همسانه سازي ژن bgn13.1 در ناقل pET26b - + - باید به صورتی انجام پذیرد که cDNA این ژن بلافاصله بعد از توالی راهنماي پپتیدي pelB همسانه سازي گردد به طوري که چارچوب بیانی ژن حفظ شود. بدین منظور آغازگر ابتداي ژن با نام FGlupETBP به نحوي طراحی گردید که جایگاه اثر آنزیم BpiI در انتهاي 5′ آن در نظر گرفته شد. در نتیجه هضم آنزیمی قطعه تکثیر شده توسط این آغازگر با آنزیم برشی BpiI، جایگاه چسبندهاي منطبق با جایگاه چسبنده حاصل از برش ناقل با آنزیم NcoI ایجاد می گردد - شکل . - 1
شکل :1 روش همسانه سازي ژن bgn13.1 در پایین دست توالی pelB ناقل pET-26b - + -
براي طراحی آغازگر انتهاي ژن در ساخت ناقل بیانی ژن bgn13.1 جایگاه تشخیصی آنزیم XhoI در انتهاي 5′ آن در نظر گرفته شد. در طراحی این آغازگر با نام RGlupETXI، رمز خاتمه ترجمه ژن bgn13.1 حذف شده و بلافاصله بعد از آخرین نوکلئوتید قبل از رمز خاتمه ژن جایگاه تشخیص آنزیم XhoI قرار داده شد. در صورت همسانه سازي قطعه تکثیر شده با این آغازگر در جایگاه شناسایی این آنزیم در ناقل pET26b - + - ، یک توالی اسید آمینه اي شامل 6 هیستیدین به صورت دنباله به انتهاي پروتئین اضافه شده که خالص سازي آن را با ستون His-Tag ممکن میسازد
