بخشی از مقاله
چکیده:
ناقل پلاﲰیدي نوترکیب pBI-Glu، از طریق آمادهسازي کاست ژنی براي ژن بتا- 1 و -3 گلوکاناز از منشأ جو، با قرار دادن این ژن ﲢت پیشﱪ CaMV35S و پایانﱪ Nos، طی مراحلی در ناحیه T-DNAي حامل پلاﲰیدي دوگانه pBI121، ساخته شد. ژن بتا- 1 و -3 گلوکاناز با کد کردن پروتئیﲏ ضدقارچی، گلوکان را که یکی از اجزاي اصلی دیواره سلوﱄ بسیاري از قارچهاي بیماري زا می باشد، ﲡزیه کرده و مقاومت گیاهان را در برابر بیماريهاي قارچی، افزایش میدهد. حامل پلاﲰیدي نوترکیب pBI-Glu را میتوان در انتقال ژن به گیاهان، با استفاده از آگروباکﱰیوم و نیز سایر روشهاي انتقال ژن، نظﲑ تفنگ ژنی، مورد استفاده قرار داد.
مقدمه:
تاآنون تعدادی از ژن هاي پاسخ دفاعی گیاهان آه پروتئﲔ هاي ضد قارچی را آد می ﳕایند، شناسایی گردیده اند که از ﲨله آهنا، ژن هاي آدآننده پروتئﲔ هاي مربوط به بیماريزائی یا 1PR میباشد، آه گروه PR-2 یکی از گروه هاي اصلی این پروتئﲔ ها بوده و بیان آن در گیاهان مقاومت آهنا را به پاتوژن هاي قارچی به طور مستقیم یا غﲑمستقیم افزایش داده است. خانواده پروتئﲔهاي PR-2 از ﲨله بتا1 _ و _3 گلوکانازها - گلوکان- اندو- 1 و -3 بتا گلوکاناز - E.C.3.2.1.39، پیوندهاي بتا_دي_گلیکوزیدي را در بتا گلوکان ها که یکی از اجزاي اصلی دیواره سلوﱄ بسیاري از قارچها میباشند، هیدرولیز می کنند و موجب تشدید خسارات وارده، به قارچ میشوند . - 1 -
مواد و روشها:
به منظور ساخت پلاﲰید نوترکیب pBI-Glu، ابتدا قطعه مربوط به 2ORF ژن گلوکاناز که در حامل پلاﲰیدي pCAMBIA1390 قرار داشت توسط آنزﱘ EcoRI هضم و قطعه مورد نظر با طول 1221bp از روي ژل آگارز خالص سازي گردید. پلاﲰید pGEM7Z، نیز با EcoRI هضم و جهت جلوگﲑي از خوداتصاﱄ پلاﲰیدي با استفاده از آنزﱘ آلکالﲔ فسفاتاز فسفرزدایی شد. واکنش اتصال به منظور ورود ORF گلوکاناز در ﳏل EcoRI از ﳏل کلون سازي چندتایی ناقل pGEM7Z اﳒام شد و ﳐلوط حاصل به سلول هاي مستعد، با استفاده از روش شوک حرارتی تراریزش شد.
غربالگري باکﱰي هاي ترارﳜته در ﳏیط LB آگار حاوي 75 میلیگرم در لیﱰ آمپیسیلﲔ به عنوان نشانگر انتخابی و ﳘچنﲔ 20 میلیگرم در لیﱰ از سوبسﱰایی به نام - شبه لاکتوز - و 20 میلیگرم در لیﱰ از یک القا کننده به نام 4IPTG بر اساس انتخاب کلونیهاي سفید از میان کلونیهاي آبی اﳒام گرفت. باکﱰي هاي نوترکیب به علت ورود قطعه مورد نظر به داخل ژن LacZ’ پلاﲰید و غﲑفعال کردن این ژن به علت عدم توانایی در سنتز بتاگالاکتوزیداز، قادر به تولید کلونی آبی نبوده و به صورت کلونی هاي سفید شناسایی شدند.
