بخشی از مقاله
چکیده :
لپتوسپیروزیس در انسان با علائم بالینی بسیار متنوع ظهور می یابد. تأخیر در درمان بیماران لپتوسپیروزي که ناشی از عدم دسترسی به تکنیکهاي کارآمد در تشخیص سریع بیماري می باشد، گاهی با عواقب مرگباري براي بیمار همراه است. از آزمونهاي PCR متعددي براي تشخیص گونه هاي پاتوژن لپتوسپیرا استفاده شده است که همگی به علت دارا بودن برخی نارسائی ها، به گستردگی مورد استفاده قرار نگرفتند.
هدف از این مطالعه طراحی یک روش nested-PCR حساس و سریع جهت ردیابی اختصاصی گونه هاي پاتوژن و غیرپاتوژن لپتوسپیرا در نمونه هاي بالینی بوده و طی آن یک قطعه 290 جفت بازي از ژن 16S rRNA که در بین اعضاي جنس لپتوسپیرا حفاظت شده است، تکثیر یافت، و در ادامه از تکنیک RFLP براي تفکیک گونه هاي پاتوژن از غیرپاتوژن استفاده گردید. سپس نتایج حاصل از آزمون PCR/RFLP با استفاده از تعیین توالی کلیه نمونه هایی که لپتوسپیروز مثبت بوده اند، تأیید شد.
بهینه سازي تکنیکها با استفاده از دو گونه استاندارد پاتوژن و غیرپاتوژن که از مرکز رفرانس WHO در فرانسه ارسال شده بود، انجام گردید. سپس با استفاده از50 نمونه سرم حاصل از بیماران مشکوك به لپتوسپیروزیس، کارایی این تکنیکها در تشخیص و تمایز هر دو گروه لپتوسپیرا در نمونه هاي کلنیکی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که تکنیک طراحی شده در این مطالعه می تواند بعنوان تکنیکی حساس و سریع جهت تشخیص گونه هاي پاتوژن و غیرپاتوژن لپتوسپیرا در نمونه هاي بالینی در مراحل اولیه بیماري مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه
لپتوسپیروزیس شایعترین بیماري زئونوز دنیاست که بواسطه گونه هاي پاتوژن جنس لپتوسپیرا ایجاد می شود 2 - ،. - 1 طی چند سال اخیر، به علت روند افزایشی مرگ و میر ناشی از لپتوسپیروزیس در کشورهاي مختلف، بویژه نواحی گرمسیري و معتدل که شرایط انتقال عامل عفونت بسیار مساعد است، این بیماري بعنوان مهمترین مشکل بهداشتی درسراسر دنیا شناخته شده است
لپتوسپیرها به طور طبیعی در توبولهاي بخش فوقانی طیف وسیعی از گونه هاي پستانداران حامل نگهداري می شوند . - 6 - این باکتریها معمولاً در تمام طول عمر حیوان آلوده، بدون بروز هیچ علامتی، از طریق ادرار حیوان دفع شده، سبب آلودگی محیط می شوند
انتقال آلودگی لپتوسپیروزي به انسان در نتیجه تماس مستقیم با حیوانات آلوده و یا تماس غیرمستقیم و از طریق آب و خاك آلوده به ادرار این حیوانات، حادث شده و ممکن است به بروز بیماري حاد و کشنده منتهی شود
در حال حاضر تشخیص این بیماري بیشتر بر اساس روشهاي سرولوژي و یا مشاهده باکتري موجود در نمونه هاي بالینی از طریق کشت ارگانیسم می باشد . - 8 - تهیه محیط کشت اختصاصی و لزوم چندین هفته انکوباسیون، بسیار وقت گیر و پرزحمت است. لذا، جهت تشخیص بموقع بیماري روش مناسبی نیست
روشهاي سرولوژي روتین براي تشخیص لپتوسپیروزیس، تست آگلوتیناسیون میکروسکوپی - MAT - و - ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay می باشند که براي تشخیص قطعی بیماري طی فاز حاد، به اندازه کافی حساس و اختصاصی نیستند
واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - بصورت گسترده براي تشخیص بیماریهاي عفونی ناشی از میکروارگانیسمهایی که به سختی کشت می یابند، مورد استفاده قرار گرفته است. لذا، از این روش براي تشخیص لپتوسپیروزیس هم استفاده شده است ولیکن به علت وجود برخی نارسائی ها نظیر عدم توانایی تفکیک لپتوسپیرهاي پاتوژن از غیر پاتوژن، و یا عدم توانایی تشخیص سریع بیماري، تکنیکهاي مولکولی که تاکنون توسط افراد مختلف طراحی شده اند، نتوانسته اند بهترین راهکار را جهت تشخیص ساده و بموقع بیماري در بیماران لپتوسپیروزي ارائه دهند.
در این مطالعه، از یک روش حساس و اختصاصی که بر پایه تکثیر بخشی از توالی ژن 16S rRNA با استفاده از تکنیک PCR/RFLP بنا نهاده شده است، جهت تشخیص افتراقی لپتوسپیرهاي پاتوژن و غیرپاتوژن در نمونه هاي بالینی استفاده شد.
مواد و روشها
نمونه هاي مورد مطالعه
در این تحقیق دو گونه استاندارد لپتوسپیراي پاتوژن و غیرپاتوژن که از مرکز رفرانس WHO در فرانسه ارسال گردیدند، جهت طراحی و بهینه سازي تکنیک مولکولی، مورد استفاده قرار گرفتند. سپس از50 نمونه سرم بیمارانی با علائم مشکوك به لپتوسپیروزیس، که توسط معاونت بهداشتی استان گیلان جمع آوري شده بودند، جهت ارزیابی تکنیک مورد نظر استفاده گردیدند و24 نمونه سرم مربوط به افرادي که طی دو هفته قبل از نمونه گیري هیچگونه علامتی که بیانگر ابتلاء به بیماري لپتوسپیروزیس باشد، نداشتند نیز بعنوان کنترل منفی مورد استفاده قرار گرفتند.
استخراج DNA از باکتري لپتوسپیرا از روش فنل/کلروفرم جهت استخراج DNA از باکتري استفاده شد.
تکثیر ژن 16S rRNA با استفاده از آزمون nested-PCR
جهت تشخیص مقادیر بسیار کم DNA در نمونه مورد آزمایش، یک واکنش nested-PCR بهینه و مورد استفاده قرار گرفت که قادر است با حساسیت و اختصاصیت بسیار بالا، بخشی از ژن 16S rRNA را که در بین تمام اعضاي جنس لپتوسپیرا حفاظت شده است، به کمک پرایمرهاي اختصاصی تکثیر نماید.
تشخیص گونه هاي پاتوژن لپتوسپیرا از گونه هاي غیرپاتوژن
پس از بررسی توالی مربوط به قطعه تکثیر یافته از ژن 16S rRNA در این مطالعه، در تعداد زیادي از گونه هاي لپتوسپیراي پاتوژن و غیرپاتوژن موجود در بانک ژنی، یک تکنیک RFLP طراحی شد و جهت تفکیک گونه هاي پاتوژن از غیرپاتوژن مورد استفاده قرار گرفت.
تأیید نتایج RFLP با استفاده تعیین توالی
به منظور تأیید نتایج حاصل از آزمونRFLP، محصول PCR کلیه نمونه هایی که لپتوسپیروز مثبت بوده اند پس از خالص سازي، تحت شرایط زنجیره سرد به شرکت کوثر واقع در تهران ارسال و توسط دستگاه Genetic Analyzer 3130 تعیین توالی شدند.
نتایج و بحث
تشخیص لپتوسپیروزیس در مراحل اولیه بیماري، نقش مهمی در درمان مؤثر بیماران و جلوگیري از عوارض جبران ناپذیر بیماري نظیر تب شدید همراه با زردي، نارسایی حاد کلیه و خونریزي مهلک ریه 8 - ،7، - 6 در آنها دارد. لذا در این مطالعه، به منظور یافتن روشی ساده جهت تشخیص سریع لپتوسپیروزیس در افرادي با علائم مشکوك، یک تکنیکPCR/RFLP بسیار حساس و اختصاصی براي ردیابی ایزوله هاي پاتوژن و غیرپاتوژن لپتوسپیرا طراحی و بهینه شد.
بهینه سازي تکنیکها شامل استخراج DNA، PCR وRFLP با استفاده از دو گونه استاندارد پاتوژن و غیرپاتوژن که از مرکز رفرانس WHO در فرانسه ارسال شده بود، انجام گردید. به این ترتیب که یک قطعه 290 جفت بازي از ژن 16S rRNA که در بین اعضاي جنس لپتوسپیرا بسیار حفاظت شده است، تکثیر یافت. نظر به اینکه در مراحل اولیه از فاز حاد بیماري تعداد باکتري موجود در مایعات بدن نظیر خون و مایع مغزي نخاعی ناچیز است، براي ایجاد حساسیت و اختصاصیت کافی جهت تشخیص مقادیر بسیار کم DNA در نمونه مورد آزمایش، یک واکنش nested-PCR بهینه و مورد استفاده قرار گرفت که می توانست تا حد 7 نانوگرم از DNA باکتري در هر میکرولیتر را شناسایی نماید. با انجام آزمون nested-PCR تنها قادریم لپتوسپیرها را در حد جنس شناسایی نماییم
در حالیکه جهت تشخیص قطعی لپتوسپیروزیس در افراد مشکوك به بیماري و اقدام به تجویز داروي مناسب جهت درمان بیمار و جلوگیري از آسیبهاي احتمالی به بافتهاي مختلف بدن نظیر کلیه، کبد و یا ریه که عموماً در نتیجه آلودگی به سرووارهاي پاتوژن لپتوسپیرا حاصل می شود، تفکیک گونه هاي پاتوژن لپتوسپیرا از انواع غیر پاتوژن الزامی است.
لذا، یک تکنیک RFLP طراحی شد که بر اساس آن یک قطعه تقریباً95 جفت بازي از ژن لپتوسپیرهاي غیرپاتوژن جدا می شود ولی ژن لپتوسپیرهاي پاتوژن فاقد جایگاه برش آنزیم می باشند. به این ترتیب محصولات PCR مربوط به نمونه هاي آلوده به انواع پاتوژن لپتوسپیرا در پایان واکنش RFLP دست نخورده باقی ماندند در حالیکه محصولات PCR مربوط به نمونه هاي آلوده به انواع غیرپاتوژن لپتوسپیرا به دو قطعه کوچکتر تقسیم شدند
پس از تأیید نتایج حاصل از تکنیک PCR/RFLP مذکور در تشخیص صحیح گونه هاي پاتوژن و غیر پاتوژن لپتوسپیرا با استفاده تعیین توالی، کارایی تکنیک در شناسایی ایزوله هاي پاتوژن و غیر پاتوژن لپتوسپیرا در نمونه هاي بالینی نیز با از استفاده از50 نمونه سرم حاصل از بیماران مشکوك به لپتوسپیروزیس ارزیابی شد و نتایج حاصل نشان داد که این تکنیک در حین سادگی و قابل اجرا بودن در آزمایشگاههاي تشخیص طبی مختلف، قادر به تشخیص قطعی بیماري در مراحل اولیه آن می باشد.
شکل :A - 1 محصولات مرحله دوم Nested-PCR قطعات DNAي تکثیر شده از ژن 16S rRNA نمونه هاي لپتوسپیراي پاتوژن وغیر پاتوژن که بر روي ژل آگارز با غلظت %2 و با بافر TBE 0.5X الکتروفورز و تفکیک شده و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي گردیدند.
چاهک شماره 3 حاوي مارکر 100 جفت بازي [100bp ladder Fermentas]، چاهک شماره 5 حاوي کنترل منفی PCR - بدون - DNA و باقی چاهکها حاوي گونه هاي استاندارد پاتوژن وغیر پاتوژن لپتوسپیرا می باشند. :B الکتروفورز قطعات حاصل از آزمون RFLP روي ژل آگارز %2/5 که با بافر TBE 0.5X الکتروفورز و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي شده است. چاهک شماره 2 حاوي گونه استاندارد غیرپاتوژن لپتوسپیرا، چاهک شماره 4 حاوي مارکر 100 جفت بازي [100bp ladder Fermentas] و باقی چاهکها حاوي گونه هاي استاندارد پاتوژن لپتوسپیرا می باشند.
