مقاله غربالگری سویه های قارچی تولیدکننده ی آنزیم گالاکتوز اکسیداز

بخشی از مقاله

چکیده

گالاکتوز اکسیداز، متالوآنزیمی با مصارف تجاری گسترده است. تولید خارج سلولی این آنزیم در گونه هایی از قارچ فوزاریوم گزارش شده است.

در این تحقیق از سه قارچ شامل Fusarium acuminatum ، Fusarium sp. 8-b-3 و Fusarium sp. 8-b-n-3 در گلوکز %1 به عنوان تنها منبع کربن رشد داده شدند و تولید آنزیم در محیط کشت حاوی نمک های مس، منگنز و منیزیم در دمای25 œC و pH=7 و دور 100 rpm در دوره های دوازده ساعته به مدت 4 روز انجام و از روش رنگ سنجی پراکسیداز/دیانیسیدین برای سنجش آنزیم استفاده شد. پس از رسم منحنی رشد و سنجش آنزیم، مشخص گردید که تنها F.acuminatum آنزیم را در ساعت 36 در محیط آزاد می سازد.

.1 مقدمه و هدف

گالاکتوز اکسیداز - oxygen-6-oxidoredutase, EC 1.1.3.9. - رادیکال آنزیمی از نوع دوم پروتئین های مس دار است که تنها منابع قارچی آن را دارند .[1] این آنزیم واکنش اکسیداسیون الکل های نوع اول را با انتقال دو الکترون و تشکیل هیدروژن پراکسید و آلدهیدهای مربوطه کاتالیز می کند .[2] این قارچ ها به دلیل اینکه محدوده ی وسیعی از الکل های نوع اول را به عنوان سوبسترا می شناسند، کاربردهای جذابی در سنتز آلی و سنتز کاتالیست ها برای اکسیداسیون الکل ها پیدا کرده اند

همچنین پایداری، ویژگی سوبسترایی گسترده، تولید هیدروژن پراکسید و نیاز به تنها مس و اکسیژن برای تشکیل یک کوفاکتور آلی، این آنزیم را برای کاربرد در حوزه های بیوتکنولوژی و پزشکی از جمله تشخیص لاکتوز و حضور گالاکتوز در خون و ادرار و سرطان، تولید بیوسنسور و استفاده در رنگ مو و کاغذ و مراقبت از دندان مناسب ساخته است

با توجه به کاربرد های مختلف گالاکتوز اکسیداز، مشکلات تولید و تخلیص آن، امروزه در مورد تولید آن از قارچ های مولد، تحقیقات گسترده ی انجام شده و شناسایی ویژگی های آنزیم در سویه ی صنعتی [2]، لزوم بررسی ترشح این آنزیم در سویه های دیگر قارچی را ضروری نموده است. در این تحقیق، در بین 3 سویه ی فوزاریوم که به منظور بررسی تولید گالاکتوز اکسیداز در محیط کشت بهینه از نظر مقدار ماده ی تلقیحی، زمان گرماگذاری، غلظت بافر، منبع کربن، حضور فلزات واسطه، دما و pH رشد کردند، بهترین سویه ی مولد آنزیم براساس مدت زمان لازم برای تولید گزارش می شود.

.2 تئوری و پیشینه تحقیق

گالاکتوز اکسیداز اولین بار در سال 1955 از قارچ Polyporus circinatus جداسازی و تخلیص شد .[7] این قارچ سپس با عنوان Dactylium dendroides - NRRL 2903; ATCC 46032 - نام گذاری شد که فرم کنیدی Hypomyces rosellus - پارازیت قارچی محیط کشت قارچ خوراکی - [13] و مایکوپارازیت Polyporus circinatus است .[6] پس از آن Dactylium dendroides با نام Fusarium graminearum، عامل بیماری "کبوتری" قارچ های خوراکی، طبقه بندی و ثبت گردید

مطالعات بسیاری پیرامون سنتز، ترشح، تولید، تخلیص و تعیین ویژگی های گالاکتوز اکسیداز از منبع صنعتی مولد این آنزیم انجام شده است. تولید صنعتی گالاکتوز اکسیداز با روش "تخمیر غرقابی" محدود به گونه ی Fusarium graminearum می باشد اما گزارش هایی از تولید و تخلیص آن از گونه های دیگر فوزاریوم مانند Fusarium moniliforme  و [2]  Fusarium  acuminatum، Fusarium  subglutinans  و  Fusarium [13]   verticillioides  نیز وجود دارد. ژن کدکننده ی گالاکتوز اکسیداز - gaoA - در  Fusarium graminearum کلون و توالی یابی شده و مدل ساختاری آن ثبت گردیده است

.3 مواد و روش ها
مواد

مواد لازم برای تهیه ی محیط کشت مایع شامل - NH4 - 2SO4، NH4NO3، Yeast extract، KH2PO4، Na2HPO4 و گلوکز هستند. نمک های مورد استفاده ی کشت MgSO4.7H2O وMnSO4.H2O و CuSO4.5H2O از شرکت مرک آلمان تهیه شدند. مواد لازم جهت سنجش گالاکتوز اکسیداز، horseradish Peroxidase - cat.P8125 - و o-dianisidine - cat.D3252 - و D-Galactose - cat.G0750 - از شرکت سیگما خریده شدند

میکروارگانیسم

قارچ Fusarium acuminatum زیرگونه ی armeniacum از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران - تهران، ایران - با کد IBRC-M 30097 تهیه شد. جدایه های Fusarium sp. 8-b-3 و-Fusarium sp. 8-b-n نمونه های فوزاریوم جدا شده از سنگ های بنای پاسارگاد و از بانک میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی محیطی، دانشکده ی علوم زیستی، دانشگاه الزهرا دریافت شد. سویه های تهیه شده در محیط کشت Potato Dextrose Agar - PDA - برای مدت 5 روز در دمای اتاق رشد داده و سپس به دمای 4 °C منتقل شدند.

شرایط رشد

محیط کشت مایع طبق آزمایش [2] Alberton et al. - 2007 - از نظر مقدار ماده ی تلقیحی، زمان گرماگذاری، غلظت بافر، منبع کربن، حضور فلزات واسطه، دما و pH بهینه شده و با تغییرات جزئی در نحوه ی استریل کردن گلوکز و هموژنیزه کردن محیط کشت و انتخاب حجم ارلن مایر، سه محلول تهیه شد: محلول A شامل 15.14 mM - NH4 - 2SO4,، 12.5 mM NH4 NO3، 0.1% yeast extract، 58 mM Na2HPO4 و 42 mM KH2PO4 و pH بهینه ی 7 که با HCl و NaOH تنظیم شد. محلول B شامل 1.62 mM MgSO4.7 H2O ، 12 M MnSO4 H2O ,10 0 &X624 5 H 2O که به همراه محلول A برای 20 دقیقه در 121 œC توسط اتوکلاو استریل شدند. محلول C حاوی 1% glucose که با فیلتر 0.22 nm استریل و به دو محلول دیگر اضافه شد. تمام غلظت های ذکر شده در حجم نهایی - 25 CC - محاسبه شده اند. در نهایت 22.5 ml محلول A، 0.5 ml محلول B و 2 ml محلول C حجم نهایی 25 ml در ارلن مایر 100 CC را تشکیل می دهند.

یک قطعه ی 1 cm3 از کشت PDA تازه به محیط مایع اضافه و با لوپ استریل داخل محیط خرد شد. محیط کشت برای مدت 4 روز در دمای 25 œC و دور 100 rpm در محیط تاریک قرار گرفت و بعد از 4 روز، با عبور از سوزن استریل 18G و سرنگ استریل، هموژنیزه و یکنواخت گردید. این محیط یکنواخت به نسبت - 2% v/v - به یک محیط 25 CC دیگر با همان ترکیبات تلقیح شد و در همان شرایط قبل - در دمای25 C° و دور 100 rpm در محیط تاریک - قرار گرفت و به مدت 96 ساعت در دوره های 12 ساعته[14] از کاغذ فیلتر عبور داده شد و فیلتر محیط برای سنجش آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. وزن خشک بیومس مسیلیوم، هر بار بعد از قرار گرفتن در دمای 50 œC اندازه گیری شد.

سنجش آنزیم

فعالیت گالاکتوز اکسیداز به روش رنگ سنجی پراکسیداز/دیانیسیدین طبق روش [17] Tressel et al. - 1982 - اندازه گیری شد. مخلوط آزمایش شامل: 0.1 ml از 0.5 M گالاکتوز به عنوان سوبسترای واکنش، 0.5 ml از نمونه - بعد از عبور از کاغذ فیلتر - و 1.4 ml محلول واکنش شامل 0.04 mg/ml - 6 U/ml - آنزیم پراکسیداز، 0.2 mg/ml دیانیسیدین حل شده در متانول - 2 mg/ml - و 50 mM بافر فسفات - است. مخلوط آزمایش 10 min در دمای 30œC انکوبه و سپس جذب آن در طول موج 460 nm خوانده شد. همچنین مخلوط آزمایشی بدون حضور گالاکتوز برای کالیبره کردن دستگاه اسپکتروفتومتر برای هر نمونه تهیه شد. یک یونیت آنزیم مقداری از آنزیم است که جذب 1.0 را در طول موج 460 nm در شرایط آزمایش ایجاد کند

.4 نتایج و بحث

از 3 قارچ بررسی شده، سویه ی Fusarium acuminatum مطابق شکل 1 در محیط خود دارای آنزیم گالاکتوز اکسیداز بود. وزن خشک میسیلیوم قارچی در یک میلی لیتر محیط مایع، در هر بار سنجش آنزیم اندازه گیری و در نمودار شکل 1 آورده شده است. حداکثر فعالیت آنزیمی این سویه طبق روش رنگ سنجی پراکسیداز/دیانیسیدین، در ساعت 36، 1.69 unit در میلی لیتر و وزن خشک میسیلیوم آن 15 g در یک میلی لیتر محیط مایع بود هرچند این سویه در ساعات 48، 84 و 96 نیز به ترتیب به میزان 0.057، 0.085 و 0.091 واحد در یک میلی لیتر محیط کشت، دارای فعالیت آنزیمی بود.