بخشی از مقاله
چکیده :
در سالهای اخیرآنتیبادیهاعمدتاً بهعنوان مهارکننده یا مسدودکننده یک رسپتور یا لیگاند برای اهداف درمانی مورداستفاده قرارگرفتهاند ولی در برخی موارد می توانند به عنوان یک القاء کننده ظاهرشوند.بنابراین قابلیت استفاده به عنوان جایگزینی برای برخی پروتئین ها از جمله فاکتورهای رشد مانند BMP2 را دارند. bmp2 یک فاکتور مورفوژنتیک کنترلکننده استخوانسازی است و در توسعه و تکامل سلول و بافت به مقدار قابلملاحظه ای نقش دارند .
BMPها ازجمله BMP2 ابتدا از طریق استخراج از بافت حیوانی و بعدتر بهصورت نوترکیب در سلولهای پروکاریوت و یوکاریوت بیان و تهیه شدند اما هرکدام از آنها دارای معایبی بودند. در حال حاضر بهترین جایگزین برای BMP2، پپتیدهای مشتق از BMP2 است که آنها هم معایب خود رادارند. ازاینرو هنوز نیازمند مطالعه بر روی مولکولهای پروتئینی جایگزین با BMP2 احساس میشود.
یکی از این گزینهها استفاده از آنتیبادیهای مرسوم یا پروتئینهای مشتق از آنتیبادیهاست .به این منظور اقدام به انتخاب کلونهای فاژی حاوی VHH علیه ناحیه اکتودمین BMPRII بهعنوان کاندید آگونیست BMP2 از طریق تکنیک فاژی شد. سپس کلونهای برگزیده تعیین توالی و درنهایت مدلسازی شدند و مورد بررسی قرار گرفتند.
مقدمه:
تشکیل استخوان فرآیند پیچیدهای است که تعداد زیادی از هورمونها و سیتوکاینها و فاکتورهای رشد در آن دخیل میباشند. همچنین ترمیم استخوان از حوادث بیولوژیک محسوب میشود که سایتوکاینها و فاکتورهای رشد متعددی آن را کنترل میکنند.یک روش در مهندسی بافت، آزادسازی فاکتورهای رشد در محل توسط حاملهای زیستتخریبپذیر بهمنظور تحریک اتصالات سلولی، تمایز و تکثیر و درنتیجه بازسازی استخوان است.
استفاده از فاکتورهای رشد بامشکلاتی چون نیمهعمر کوتاه، فقدان پایداری طولانی مدت در محل، اختصاصیت بافتی، پتانسیل سرطانزایی وابسته به دز، درجه اثر متفاوت فاکتورهای رشد مختلف وابسته به نوع استخوان و نیاز به دوز بالا و هزینه گران و همچنین واکنشهای ایمونولوژیک و تشکیل هتروتوپیک استخوان و ادم همراه بوده است؛ بنابراین فاکتورهای رشد محدودی که دارای حداکثر اثربخشی بیولوژیک در بافت استخوان هدف باشند موفق به تأییدیه FAD شدهاند که BMP2 و BMP7 از آن جملهاند. BMPجز فاکتورهای رشد پلی پپتیدی ترشحی متعلق به سوپر فامیلی TGF- هستند که اولین بار بهعنوان القاء کننده تشکیل استخوان مشخصشدهاند. این فاکتورهای رشد طیف گستردهای از عملکردهای رشد ونمو، هموستاز سلولی مثل مهاجرت، تمایز، آپوپتوزو تکثیر را تنظیم میکنند.
هرمنومر BMP حاوی حدوداً120 اسیدآمینه است که در طبیعت به شکل همودایمر هستند و دومنومر آنها بهوسیله یک پیوند دی سولفیدی به هم وصل شدهاند.در میان BMP ها، BMP2 به دلیل فراوانی در عصاره پروتئینی مورفوژنیک استخوان طبیعی اهمیت ویژهای داشته بهطوریکه در طی توسعه و تکامل سلول و بافت به مقدار قابلملاحظه ای بیان میشود. ترتیب رخدادهای القای استخوان آغازشده بهوسیلهی BMP2 مثل شکلگیری استخوانهای endochondral در دوره جنینی پیشنهاد میکند که BMP2 یک فاکتور مورفوژنتیک کنترلکننده استخوانسازی است.
شش نوع گیرنده مختلف برای اتصال به BMP شناساییشده است؛ - Activin receptor type Ia - ActRIa or Alk2 و BM Preceptor type Ia - BRIa or Alk3 - و BMP receptor type Ib - BRIb or Alk6 - که به همراه رسپتورهای تیپ II کمپلکسهای هترومریک تشکیل میدهند: Activin receptors type IIA and IIB - ActRIIA and ActRIIB - و - . BM P receptor type II - BRII این رسپتورها دارای یک دومین اتصالی خارج سلولی و یک دومین درونسلولی با فعالیت سرین/ترئونین کینازی میباشند. رسپتورهای تیپ I دارای یک ناحیه سرشار از گلیسین و سرین که به GS-box معروف است، میباشند.BM P ها با تمایل مختلف به رسپتورهای تیپ I و II متصل میشوندو بااتصال به رسپتور خود منجر به راهاندازی دو مسیر میشود: BMP/Smad و BMP/MAPK
مسیر BM P/Smad بااتصال BM P2ها به Pre-formed receptor complexes - PFC - آغاز میشود که شامل دو رسپتور تیپ I و دو رسپتور تیپII میباشد. رسپتورهای تیپ II، رسپتورهای تیپ I را در محل box-GS فسفریله کرده و رسپتورهای تیپ I با فسفریله کردن - Receptor-activated Smads - RSmad سبب آزادسازی آنها ازرسپتور تیپI شده و به - co-mediator Smads - Co-mads پیوسته و تشکیل کمپلکس هتروالیگومریک داده و این کمپلکس به سمت هسته حرکت کرده و سبب فعال شدن رونویسی از یک سری ژنها میشوند. همه R-Smad ها توسط BM P2 و یا BM P4فعال میشوند درحالیکه BM P6,BM P7,BM P9 تنها میتوانند Sm ad1 و Sm ad5 را فعال کنند.
در مسیر BMP/MAPK، اتصال BM P به دو رسپتورتیپ I باعث فراخوانی دورسپتور تیپ II شده و باعث فعال شدن P38و TGF-1 - - TAK1 - و راهاندازی مسیر P38- M APK شده و درنهایت باعث القا آلکالین فسفاتاز ومتعاقباً تعدادی پاسخ سلولی میشود.در مسیر Smad رسپتورهای تیپII مهمترین نقش آغازی رادارند. BMPRII همانطور که گفته شد عضوی از خانواده رسپتورهای TGF- هستند اما تفاوتهایی نیز باآنهادارد. در سیگنال TGF- همه رسپتورها قبل از اتصال لیگاند به شکل همودایمر هستند امادرمورد BMPRII تنها یکقسمتی ازرسپتور قبل از اتصال لیگاند به شکل فرم هومومریک است بعد از اتصال لیگاند الیگومریزه شدن رسپتورهای هومومریک افزایشیافته و به سمت همودایمر شدن میروند. زنجیره رسپتورهای تیپ IIبه BMP2 محلول اتصال میابند اما با افینیتی پایین، اما زمانی که زنجیرههای تیپ IIدر کنار تیپI قرار بگیرند افینیتی آنها افزایش مییابد.
بعد از شناسایی BMP ها در سال 1965 توسط Urist، BM P ها از بافت استخوانی حیواناتی چون خرگوش، گاو و انسان استخراج شد. ولی یکی از مشکلات مربوطه استخراج مقدار کم Nature BMP بود. درحالیکه درمهندسی بافت مقدار بیشتری از BMP نیاز بود؛ بنابراین ایده تولید BMP های نوترکیب به میان آمد؛ که سیستمهای بیانی پروکاریوت مانند اشریشیاکلی برای این کار استفاده شد که باعث رسوب پروتئین در سیتوپلاسم میشد. به خاطر تولید پروتئین به شکل اجسام تجمعی در سیتوپلاسم پروکاریوتها و بهکارگیری فرآیندهای تاخوردگی مجدد وتخلیص برای دستیابی به پروتئین فعال دارویی و نبود سیستم اصلاحات پس از ترجمه در آنها، استفاده از میزبانهای یوکاریوتی مطرح میشود؛ که در این میان سلولهای CHO دارای اهمیت است و اولین بار در سال - Recombinant Human BMP2 - rhBMP21990 در همین سلولها بیان شد که توانایی القا بافت استخوانی و غضروفی رادرمحل آسیبدیده داشت.
ازآنجاییکه BMP2 همانند دیگر BMP ها گلیکوپروتئینهای تنظیمی به شکل همودایمر و یا هترودایمر هستند وهرمونومر آن 120 اسیدآمینه دارد و حاوی 7 ریشه سیستئینی حفاظتشده که تشکیل 3 باند دی سولفیدی درونمولکولی و یک باند دی سولفید بینمولکولی میدهد پس کنترل مولکول کامل آن در محیط آزمایشگاه سخت است.
همچنین روشهای تولید BMP دارای محدودیت است، پایدار کردن و افزایش نیمهعمر آنها و حضور آنتاگونیست ها وجهش در اپی توپهای اتصالی و تغییر افینیتی آنها نسبت به رسپتورها، نیاز به دوز بالا و عوارض جانبی همراه و یافتن یک حامل مناسب که سبب پایداری و آزادسازی آنها در محل موردنظر، از مشکلات مطرحشده در ارتباط با آنهاست. همچنین بهکارگیری مولکولهای BMP2 به دلیل سایز بزرگ در داربستها و نانو ذرات دارای محدودیتهای زیادی است. به همین دلیل به دنبال مولکولهای جایگزین با BMP2هستند بهطوریکه با همان ویژگیهای BMP2 محدودیتهای استفاده از آن را نداشته باشند.
تاکنون بهترین جایگزین برای BMP2، پپتیدهای مشتق از BMP2 میباشد. یکی از بهترین انتخابها برای این منظور استفاده از پپتیدهای مشتق از BMP2خصوصاً پپتیدهای مشابه با دمین فعال BMP2در اتصال با گیرنده تیپ II میباشد و نتایج مطلوبی نیز با استفاده از این نوع پپتیدها بهدستآمده بهطوریکه برخی از آنها در فاز مطالعات بالینی در FADآمریکا میباشد. علیرغم مقبولیت فعالیت پپتیدهای مشتق از BMP2، هنوز محدودیتهای استفاده از پپتیدها به دلیل نیمهعمر کوتاه آنها و کلیرانس بالای آن در کلیه باعث محدودیت در استفاده از پپتیدها شده است.
ازاینرو هنوز نیازمند مطالعه بر روی مولکولهای پروتئینی جایگزین با BMP2 احساس میشود. یکی از این گزینهها استفاده از آنتیبادیهای مرسوم یا پروتئینهای مشتق از آنتیبادیها میباشد. آنتیبادیها در بهترین شرایط و با بیشترین پراکندگیعمدتاً بهعنوان مهارکننده یا مسدودکننده یک رسپتور یا لیگاند برای اهداف درمانی مورداستفاده قرارگرفتهاند ولی در برخی از موارد مثل القای آپوپتوز در گیرنده DR5 که آگونیست TRIAL میباشد، این آنتیبادی نه مهارکننده است نه مسدودکننده بلکه اثر TRIAL را تقلید کرده و باعث القای آپوپتوز میشود.
در مثال اخیر آنتیبادی درست به دمین اتصالی TRIAL روی گیرنده DR5 وصل شده و باعث القای آپوپتوز در سلول شود بهعبارتدیگر آنتیبادی عملکرد TRIAL را تقلید و آگونیست آن میباشد. با این رویکرد و باهدف انتخاب یک آنتیبادی تک زنجیره شتری - VHH - بهعنوان کاندید آگونیست BMP2، اقدام به انتخاب کلونهای فاژی VHH علیه ناحیه اکتودمین BMPRII شد ودر ادامه این کلونها مورد بررسی بیشتر قرار گرفت.
مواد و روشها:
· آنتی ژن : BMPRII در این تحقیق ناحیه اکتودمین رسپتور BMPRII که در باکتری Shuffle بیان گرفته شده بود به عنوان آنتی ژن جهت جداسازی فاژهای تمایلی استفاده شد.
· رها سازی و تخلیص فاژ نوترکیب و تعیین تیترآن : در این تحقیق از کتابخانه فاژی که در آزمایشگاه دکترحسن نیا ساخته شده بود،استفاده شد.به منظور رهاسازی و تخلیص فاژ نوترکیب از روش زیر استفاده شد:
.1 از پیش کشت کتابخانه VHH، ،O 300 به ارلن حاوی 30 ml محیط SB اضافه و تا زمان رسیدن جذب نوری
- OD - در طول موج 600nm به 0/5 در دمای 37 C و دور 250rpm انکوبه شد.
.2 1 ml فاژ کمکیM13KO7 با تیتر 1012 به محیط اضافه و به مدت نیم ساعت بدون حرکت در 37 C
انکوبه شد.
.3 بعد از گذشت نیم ساعت آنتی بیوتیک کانامایسین - 40ʽg/ml - اضافه و مجدداً در 37 C، دور250 rpm به
مدت 1/5ساعت انکوبه شد.
