بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه وهدف: اشریشیاکلی قسمتی از میکروفلور طبیعی رودهای است که برخی جدایههای آن بیماریزا میباشند. . با توجه به پرورش صنعتی و سنتی گاومیش در استان خوزستان و نقش بسیار مهم این دام در تأمین پروتئین و مواد لبنی مورد نیاز جمعیت انسانی، شناسائی پاتوتیپ های بیماریزای انسان و دام در گاومیش ها ضروری به نظر می رسد تا بتوان با توجه به نتایج این تحقیقات و معیار های پیش گیری را در این زمینه تدوین نمود.هدف از انجام این مطالعه شناسایی ژن حدت eae جدایه های اشریشیاکلی از مدفوع ولاشه گاومیش های ذبح در شهرستان اهواز است.
مواد و روش کار: برای این منظور 102 نمونه ازمدفوع و 102 نمونه از لاشه گاومیش اخذ گردید و نمونه ها در محیط های مناسب جهت شناسایی اشریشیاکلی کشت داده شدند و با استفاده از آزمایشات بیوشیمیایی مورد تأیید قرار گرفتند. از آزمایش PCR جهت شناسایی حضور و شیوع ژن حدت eae استفاده گردید. نتایج: از 102 نمونه مدفوعی گرفته شده از گاومیش ها 96 مورد باکتری اشریشیاکلی جداسازی شد و از 102 نمونه لاشه 49 جدایه باکتری جداسازی شد. بر اساس نتایج 6 جدایه 6 /25 - درصد - از نمونه های مدفوعی و 2 جدایه 4 /08 - درصد - نسبت به ژن eae مثبت بودند.
مقدمه
باکتری اشریشیاکلی به عنوان فلور نرمال دستگاه گوارش در حیوانات خونگرم محسوب می شود. سویه های پاتوژن آن طیف وسیعی از بیماری های خارج روده ای و اسهال را ایجاد می کنند - . - 6 جدایه های اشریشیاکلی براساس فاکتورهای حدت، فنوتیپ و بیماری زایی به پاتوتیپ های مختلفی تقسیم می شود: اشریشیاکلی انتروپاتوژنیک - EPEC1 - ، اشریشیاکلی تولیدکننده ی انتروتوکسین - ETEC2 - ، اشریشیاکلی تولید کننده ی شیگاتوکسین - STEC3 - ، اشریشیاکلی مهاجم روده ای - EIEC4 - ، اشریشیاکلی نکروتوکسیک - NTEC5 - ، اشریشیاکلی مجتمع شونده ی روده ای - EAggEC6 - و اشریشیاکلی بهم چسبیده ی انتشاری - DAEC7 - طبقه بندی می شود.
اشریشیاکلی انتروپاتوژنیک یکی از مهمترین عوامل ایجاد اسهال در گاوسانان محسوب می شود که به وسیله اینتیمین - ژن - eae به سلول های اپیتلیال روده می چسبد و با تولید فاکتورهای حدت متفاوت سبب بروز بیماری می شود مانند دسته ژن های LEE، که موجب ضایعات چسبنده و محو کننده در انتروسیت ها می شود - -13 . - 9-11 اشریشیاکلی تولید کننده ی شیگاتوکسین بیماری زایی در اصل به دلیل تولید دو سیتوتوکسین با نام های شیگاتوکسین 1 و شیگاتوکسین2 می باشد که توسط دو ژنstx1 وstx2 کد می گردد . - 7-5-4 - سویه های STEC، علاوه بر عوامل حدت نام برده، می توانند دارای فاکتور های حدت دیگری نیز باشند. برخی از سویه های STEC می توانند دارای یک پروتئین بر روی غشای خارجی خود باشند که اینتیمین - intimin - نام دارد و توسط ژنی با نام eae کد می گردد. اینتیمین - intimin - یک پروتیین94-KDa غشای خارجی می باشد و به وسیله ژن eae کد می شود.این پروتیین مسئول اتصال نزدیک باکتری به سلول های به سلول های اپیتلیال روده و ایجاد آسیب های خاصی به نام اتصال و محو شدن - - Attaching/effacing است
یکی از بزرگترین جمعیت های گاومیش در ایران گاومیش خوزستانی است با 138 هزار رأس در منطقه جنوب ایران. گاومیش با ویژگی های منحصر به فرد خود نظیر استفاده از منابع غذایی کم قیمت، توان بالای سازگاری با محیط اطراف و مقاومت در برابر بیماری ها و نیز تولید گوشت و شیر با ارزش می تواند تحول بزرگی در اقتصاد ایجاد کند
با توجه به پرورش صنعتی و سنتی گاومیش در استان خوزستان و نقش بسیار مهم این دام در تأمین پروتئین و مواد لبنی مورد نیاز جمعیت انسانی، شناسائی پاتوتیپ های بیماریزای انسان و دام در گاومیش ها ضروری به نظر می رسد تا بتوان با توجه به نتایج این تحقیقات و معیار های پیش گیری را در این زمینه تدوین نمود.
مواد و روشها
در این مطالع تعداد 102 نمونه مدفوعی و 102 نمونه لاشه از گاومیش های ذبح شده در استان خوزستان به مدت 6 ماه جمع آوری شد. پس از کشت نمونه های فوق در محیط های افتراقی، اختصاصی و استفاده از آزمون های بیوشیمیایی استاندارد، تعداد 96 جدایه اشریشیاکلی از مدفوع و 43 جدایه اشریشیاکلی از لاشه تعیین هویت گردید - . - 3 جهت ذخیره سازی جدایه ها از هر نمونه مدفوعی و لاشه، دو تا سه کلونی تایید شده در دمای-80 درجه ذخیره خواهد شد. روش ذخیره سازی به این صورت بود که هر جدایه را به طور جداگانه در محیط Luria Bertani Broth - LBB - کشت داده شده و پس از انکوباسیون در دمای 37 به مدت 24 ساعت و پس از افزودن گلیسرول 50 درصد ذخیره شدند.
از هر یک از جدایه ها و سویه های استاندارد DNA ، به روش لیز با استفاده از NaOH نیم مولار استخراج می شود. برای این منظور ابتدا باکتری در محیط Luria Bertani Agar - LBA - کشت داده شده و بعد از برداشت از کلنی کشت داده شده به میکروتیوبهای حاوی 25 میکرولیتر NaOH نیم نرمال، اضافه می گردد. . پس از گذشت 30- 20 دقیقه، 25 میکرولیتر تریس 1 مولار به محلول فوق اضافه خواهد شد تا عمل هضم باکتری توسط NaOH متوقف گردد.
سپس با افزودن 450 میکرولیتر آب مقطر استریل، حجم محلول را به 500 میکرولیتر می رسد که به عنوان DNA استخراج شده در آزمایش PCR مورد استفاده د قرار خواهد گرفت. سپس در آزمایش مولتی پلکس PCR جهت شناسائی به منظور شناسایی ژنتیکی ژن های stx1، stx2، eae مورد استفاده قرار گرفت. برای انجام آزمایش PCR از پرایمرهای اختصاصی شناسایی ژنتیکی جدایه های تولید کننده ی شیگاتوکسین، ژن حدت eae در جدایه ها بر اساس مطالعه ی Paton در سال 1998، مورد بررسی قرار گرفت.
