بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم ها پروتئین هایی در نقش کاتالیزور هستند که توسط منابع میکروبی مانند قارچ ها، باکتری ها، نماتدها و غیره تولید می شوند و در مصارف بیوتکنولوژیک متعدد مانند کشاورزی، صنایع غذایی، تصفیه پساب ها و موارد دیگر کاربردهای گوناگونی دارند. سلولازها آنزیم هایی هستند که توسط برخی قارچ ها به منظور نفوذ به دیواره سلولی گیاهان ایجاد می شوند.زیرا که سلولز، پلی ساکارید دردسترس برای آن ها می باشند.
این آنزیم ها، از جمله آنزیم های مهم صنعتی می باشند که در کشاورزی به منظور تجزیه ضایعات لیگنو سلولزیک،در صنایع غذایی برای کاهش سلولز و مواد غذایی، شفاف سازی آب میوه، صنعت کاغذسازی و غیره کاربرد دارند.در این تحقیق، فعالیت سلولازی برخی قارچ های اندوفیت شامل سه گونه از جنس بیسکوگنیاکسیا1 بررسی شدند. برای این منظور از محیط کشت اختصاصی کربوکسی متیل سلولز برای تولید آنزیم سلولاز استفاده شد.سه روز پس از تلقیح قارچ ها در محیط کشت،به مدت سی روز به کمک معرف ها میزان قند های تولید شده حاصل از تجزیه سلولز و پروتئین های ترشحی مورد سنجش قرار گرفت و نتایج حاصل با نرم افزار اس پی اس اس 2تجزیه و تحلیل گردید.نتایج نشان داد که جدایه های این جنس به لحاظ تولید آنزیم متفاوتند.
مقدمه
سابقه استفاده از فرآیند های مرتبط با آنزیم ها به تمدن های قدیمی باز میگردد. افزایش دانش بشر و پیشرفت های به دست آمده در کنار آن، امکان جداسازی و استفاده از آنزیم ها در غیاب ارگانیسم منبع یا مولد را فراهم کرده است. تا جایی که برخی از آن ها به کالاهای تجارتی گران قیمتی تبدیل شده اند. غالب آنزیم های صنعتی منشا میکروارگانیسمی و به ویژه قارچی دارند
آنزیم ها جایگاه خود را در بسیاری از فرآیندهای صنعتی جدید پیدا کرده اند. آنزیم های میکروبی به صورت روزافزون دربسیاری بخش های صنعتی اقتصادی مرتبط با عوامل محیطی استفاده می شوند.[2]سلولاز نام عمومی برای گروهی از آنزیم های وابسته به مشتقات سلوالیگوساکارید است که هیدرولیز سلولز را انجام می دهند.سلولاز شامل سه ترکیب مهم می باشد..
کربوکسی متیل سلولاز،.2 اندوبتاگلوکاناز و اگزوبتاگلوکاناز و.3بتاگلوسیداز.مشکل اصلی کاربرد سلولاز ها درصنعت قیمت گزاف تولید صنعتی آن هاست.[ 3]افزایش تقاضا در جایگزینی بعضی فرآیندهای شیمیایی متداول با فرآیندهای بیوتکنولوژی شامل میکروارگانیسم ها و آنزیم هایی همچون پکتینازها،سلولازها و لیگنینازها که رابطه نزدیک تری با عوامل محیطی دارند،وجود دارد
قارچ های اندوفیت در بخش های داخلی تقریبا تمامی گیاهان زنده روی کره زمین ، از گیاهان مناطق سردسیر تا گرمسیری ساکن هستند.رابطه میان قارچ اندوفیت و میزبان به عنوان یک تعادل مابین فازهای همیاری3 ،همزیستی4 و بیمارگری5 تعریف شده است.[5] درطول سه دهه گذشته، قارچ های اندوفیت در میان تاکسونومیست ها، قارچ شناس ها ، اکولوژیست ها ، شیمیدانان و زیست تکاملی شناسان توجهات فراوانی را به خود جلب کرده است
در این تحقیق سعی برآن است که جدایه های قارچی متعلق به یک جنس،به لحاظ تولید آنزیم سلولاز مورد بررسی قرار گرفته،تفاوت گونه های متعلق به یک جنس در میزان قند احیا شده در اثر تولید آنزیم مشخص شده و از بین آن ها جدایه های برتر به لحاظ تولید آنزیم برای استفاده در مصارف آنزیمی پیشنهاد گردد.
، 0/25 گرم سولفات روی، 0/25 گرم سولفات آمونیوم، 2 گرم فسفات هیدروژن پتاسیم، 0/25 گرم سولفات منیزم، 0/4 گرم کلرید کلسیم، 10 گرم کربوکسی متیل سلولز ، 0/3 گرم اوره، 0/2 گرم توئین80و 1 گرم پپتون استفاده شده و با آب مقطر به حجم نهایی 1 لیتر رسانده شد.سپس محیط کشت آماده شده، در20 شیشه ی 120 میلی لیتری - شیشه شربت - به طوری که در هرشیشه، 50 میلی لیتر از محیط کشت سی ام سی جای گیرد،تقسیم شد.
محیط های درون شیشه ها، در دمای 121 درجه سانتیگراد در دستگاه اتوکلاو به مدت 20دقیقه استریل شدند. هر محیط کشت با دوعدد آگار - قرص آگار - ، از محیط کشت جامد پی دی ای، با قطر تقریبی 6 میلی متر ، به طوری که برای هر گونه قارچی سه تکراردر نظر گرفته شود،تلقیح شده و محیط های کشت مایه زنی شده به همراه سه تکرار برای محیط های کشت شاهد - بدون تلقیح - ،به مدت30 روز در دمای محیط و بدون تکان و در تاریکی انکوبه شدند.
به منظور تعیین غلظت کلی قندهای تولید شده - قند سنجی - با معرف دی ان اس10، بااستفاده از روش میلر[9]،با اندکی تغییر، ابتدا 400 میکرولیتر از محلول را در لوله آزمایش ریخته و 400 میکرو لیتر از محلول دس ان اس افزوده شد. لوله ها به مدت 5 دقیقه در حمام آب جوش - 100 درجه سانتی گراد - قرار داده شده و پس از سرد شدن 3/2 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد و با وورتکس 11، محتویات داخل لوله ها خوب مخلوط گردید.
لوله ها به مدت 20 دقیقه به حال خود رها شده و جذب نور نمونه ها در طول موج 540 نانومتر اندازه گیری شد. برای تهیه محلول معرف دی ان اس بااستفاده از روش میلر، یک گرم پودر دی ان اس در20 میلی لیتر سود 2 نرمال حل گردید.سپس 30گرم سدیم پتاسیم تارتارات که قبلاّ در 50 میلی لیتر آب مقطر حل شده به آن اضافه شد.محلول روی همزن الکتریکی به مدت20 دقیقه قرار داده شده سپس با آب مقطر به حجم نهایی 100 میلی لیتر رسانده شد.محلول قند سنجی آماده شده در ظرف شیشه ای رنگی و درون یخچال 4درجه سانتی گراد و دور از نور قرار گرفته شد.
به منظور تهیه منحنی استاندارد قند سنجی ابتدا 0/1 گرم گلوکز با 100 میلی لیتر آب مقطر محلول کرده و غلظت 1 گرم بر لیتر محلول گلوکز درآب به دست آمد.از محلول به دست آمده غلظت های بین 0/01تا 0/9 گرم بر لیتر تهیه شد.سپس در 19 لوله آزمایش، هرکدام با غلظت مشخصی از محلول و در حجم نهایی 1 میلی لیتر، به عنوان نمونه اقدام به قندسنجی شد. جذب نور در دستگاه اسپکتروفوتومتر12 با طول موج 540 نانومتر سنجیده شد. از سنجش چگالی نوری13 این محلول ها به روش ذکرشده - میلر - ،
بررسی منابع
طی بررسی های به عمل آمده در زمینه فعالیت لیگنوسلولتیک قارچ بازیدیومیست پلئوروتوس درینوس 1در محیط کشت مایع تخمیری - طی شرایط بی هوازی - و همچنین روی محیط پوست نارنگی و برگ برخی درختان به این موضوع اشاره شد که در سال های اخیر استفاده سودمند از ضایعات صنعتی کشاورزی برای تولید محصولات با ارزش افزوده از قبیل قارچ های خوراکی، اتانول، آنزیم ها، اسیدهای ارگانیک و غیره روند رو به رشدی داشته است.همچین تاکید شد که قارچ های بازیدیومیست پوسیدگی سفید، به سبب توانایی تولید ترکیبات هیدرولیتیک - سلولاز و همی سلولاز - تجزیه کنندگان کارآمدی برای سلولز هستند
طی بررسی تولید آنزیم های حل کنده سلولز و همی سلولز توسط قارچ ها ی رشته ای رشد کرده روی محیط اکسیداز مرطوب در کاه گندم، ضمن تاکید به مصرف کاه گندم به عنوان سوبسترای سلولزی این مطلب را بیان داشتند که سلولز براحتی و بدون تیمارهای فیزیکی و شیمیایی به گلوکز تبدیل نمی شود و غلبه بر مقاومت سلولز در شکسته شدن، مستلزم غلبه بر ساختار نسبتا کریستالی آن است.آن ها خاطر نشان کردند که فرآیندهایی که در کاه گندم رخ می دهد، در هیدرولیز اسیدی و انفجار بخار و اکسیداسیون در شرایط مرطوب صورت می پذیرد.در ادامه نتایج تحقیقات آن ها حاکی ازین بود که از میان گونه های مورد بررسی بیشترین میزان فعالیت سلولازی و اندوگلوکانازی مربوط به قارچ های پنیسیلیوم براسیلینوم2و پوترایتیس سینرئا3می باشد.
مواد و روش ها
قارچ های بیسکوگنیاکسیا آتروپونکتاتا4، بیسکوگنیاکسیا نومولاریا5و بیسکوگنیاکسیا مدیترانئا 6 ازآزمایشگاه قارچ شناسی دانشکده علوم زراعی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری جمع آوری شده، جهت اطمینان از خلوص، برروی محیط کشت آب-آگار 7و سپس با تحت کشت قرار دادن نوک هیف رشد کرده ی قارچ بر روی محیط پی دی ای 8خالص سازی شدند. ارزیابی تجزیه سلولز در شرایط آزمایشگاهی با تهیه محیط کمینه حاوی منابع ازت و میکروالمنت ها و کربوکسی متیل سلولز - سی ام سی - 9به عنوان تنها منبع کربن انجام شد.برای تهیه 1 لیتر محیط کشت، 5 میلی گرم سولفات آهن منحنی استانداردی با R2= 0.9847و معادله خط - Y=0.8395X به دست آمد. در این معادله X جذب نوری و Y غلظت گلوکز بر حسب گرم بر لیتر می باشد
نمودار-2منحنی استاندارد پروتئین سنجی
در ادامه آزمایش فاکتوریل در غالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد.برای انجام مقایسه میانگین از آزمون دانکن استفاده شد. پس از پردازش داده ها در محیط نرم افزار اکسل 16، جهت آنالیز آماری داده ها از نرم افزار آماری اس پی اس اس17استفاده شد.
نتایج
با استفاده از آزمون آنووای یک طرفه برای مقایسه میانگین تولید قند و پروتئین ترشحی طی سی روز بین سه جدایه، نتایج زیر به دست آمد. - شماره های 1، 2و3 به ترتیب گونه های بیسکوگنیاکسیا آتروپونکتاتا18، بیسکوگنیاکسیا نومولاریا19و بیسکوگنیاکسیا مدیترانئا 20 هستند. -
جدول-1مقایسه میانگین میزان تولید قند و پروتئین طی یک ماه
در نمودار3 میانگین نغییرات قند احیا شده و در نمودار4 میانگین پروتئین تولید شده برای سه ایزوله 1، 2 و3 نشان داده شده است.
نمودار-1منحنی استاندارد قندسنجی
غلظت پروتئین های برون سلولی تولید شده درمحیط کشت با استفاده از روش برادفورد[10] تعیین شد.برای این منظور از یک پروتئین استاندارد14 شیب غلظت تهیه و بعد از افزودن معرف برادفورد، و صرف زمان حداقل 2 دقیقه، جذب نوری نمونه ها درطول موج 595 نانومتر اندازه گیری شد. با استفاده از منحنی به دست آمده،میزان پروتئین موجود در نمونه های گرفته شده از محیط های کشت، مشخص گردید.به منظور تهیه معرف برادفورد مقدار 0/1 گرم کوماسی بلوی جی-15 250 در 50 میلی لیتر اتانول حل شده و سپس 100 میلی لیتر اسید فسفریک %85 به آن اضافه گردید.بعد از چنددقیقه هم زدن ، با آب مقطر به حجم نهایی 1 لیتر رسانده شد.محلول مورد نظر قبل از استفاده از کاغذ صافی عبور داده شد با استنباط به روش بونین،[11] ابتدا محلول بی اس ای با غلظت 1 گرم بر لیتر تهیه شد.سپس در19 لوله آزمایش هرکدام با غلظت های مشخص و در حجم نهایی 100 میکرولیتر ریخته شد.سپس 5میلی لیتر محلول برادفورد به هرلوله اضافه شد.
برای رسم منحنی استاندارد پروتئین، غلظت های 0/01تا 0/9 گرم بر لیتر از پروتئین بی اس ای در نظر گرفته شد.از سنجش چگالی نوری به دست آمده به روش برادفورد، منحنی استانداردی باR2=984 و معادله خط Y=0.4833X-0.0193 به دست آمد.در این معادله، X جذب نوری و Y غلظت پروتئین می باشد.
