بخشی از مقاله

چکیده

جنس اکالیپتوس - از خانواده - Myrtaceae با بیش از 700 گونه عمدتا بومی استرالیا است. این گیاه چوبی مورد حمله قارچ های بیمارگر مختلفی همچون گونه های Mycosphaerella و Teratosphaeria و همچنین گونه های Botryosphaeriaceae قرار می گیرد. در طول تابستان سال 1395 درختان اکالیپتوس که دارای نشانه های بیماری مانند زردی و سرخشکیدگی بودند در جزیره کیش - ایران - مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه برداری از شاخه درختان دارای نشانه های بیماری انجام شد.

جداسازی قارچ ها نیز از بافت های تغییر رنگ یافته بافت چوب شاخه ها و بر روی محیط کشت عصاره سیب زمین-دکستروز-آگار - PDA - صورت گرفت. 16 جدایه از Botryosphaeriaceae جداسازی گردید که بر اساس ویژگی های ریخت شناختی و مقایسه داده های بدست آمده از تعیین ترادف ناحیه ITS و ژن TEF مورد بررسی قرار گرفتند. دو گونه به عنوان 12 - Diplodia seriata جدایه - و 4 - Lasiodiplodia theobromae جدایه - شناسایی گردید. این اولین گزارش از L. theobromae بر روی اکالیپتوس در ایران و اولین گزارش از D. seriata بر روی این درخت در دنیا می باشد.

-1مقدمه

درخت اکالیپتوس متعلق به جنس Eucalyptus از خانواده Myrtaceae میباشد . اکالیپتوس درختی تک تنه، بزرگ و همیشه سبز است و بومی استرالیا میباشد. این درخت نیز مانند بسیاری از درختان زینتی دیگر مورد هجوم بیماری ها و آفات مختلف قرار می گیرد. یکی از بیمارگرهای مهم که امروزه مورد توجه قرار گرفته است اعضای خانواده Botryosphaeriaceae هستند که می توانند به شکل های مختلف بیمارگر، درون زیست یا پوده رست عمل کنند. اعضای این خانواده دارای انتشار جهانی بوده و بیماری های مختلفی بر روی طیف وسیعی از درختان و درختچه های چوبی ایجاد می کنند

اهمیت گونه های خانواده Botryosphaeriaceae در ایجاد بیماری بر روی میزبان های مختلف بسته به مناطق مورد مطالعه متفاوت گزارش شده است. گونه تیپ این جنس Botryosphaeria dothidea می باشد. جنس Botryosphaeria از لحاظ تاکسونومیکی در شاخه Ascomycota، رده Dothideomycets، زیر رده Dothideomycetidae، راسته Botryosphaeriales و خانواده Botryosphaeriaceae قرار می گیرد.

در حال حاضر گونه های بسیاری در این جنس معرفی شده است که در سر تا سر دنیا گسترش دارند Crous et al., 2006; Phillips et al., ] .[2013 تاکنون گیاهان چوبی مختلفی به عنوان میزبان اعضای Botryosphaeriaceae گزارش شده اند که در این میان گونه های مختلف اکالیپتوس هم دیده می شود. بررسی منابع مختلف نشان می دهد که گونه هایی همچون B. dothidea [Taylor et al., 2009]،[Slippers et al., 2009] Lasiodiplodia theobromae، Chen et al., ] B. fabicerciana [2011، [Pavlic et al., 2008] B. ramose، [Perez et al., 2010] Lasiodiplodia crassispora و [Mohali et al., 2006 ] Neofusicoccum andinum از این درختان در مناطق مختلفی از دنیا گزارش شده اند

بررسی ها در ایران نیز نشان می دهد که برخی از گونه های این خانواده از درختان اکالیپتوس جداسازی شده اند. به عنوان مثال گونه Lasiodiplodia iraniensis قبلا از اکالیپتوس توسط عبداالله زاده و همکاران - 2010 - جداسازی و گزارش شده است. در ایران درختان زینتی و همچنین درختان میوه دیگری نیز به عنوان میزبان اعضای خانواده Botryosphaeriaceae گزارش شده اند که می توان به درختان بید و صنوبر [Hashemi and Mohammadi, 2016] و حتی درختان نخل اشاره نمود .[Mohammadi et al., 2014] با این وجود هنوز اطلاع دقیق از تنوع گونه های این خانواده بیمارگر زا قارچ ها در ایران در دست نمی باشد.

-2مواد و روش های بررسی

-1-2نمونه برداری

در طول تابستان 1395از درختان اکالیپتوس در جزیره کیش بازدید صورت گرفت و از شاخه درختانی که دارای علائم بیماری نظیر زردی، سرخشکیدگی و کم برگی بودند نمونه برداری انجام گرفت. شاخه های نمونه برداری شده به منظور جداسازی عوامل قارچی به آزمایشگاه منتقل شدند.

-2-2جداسازی عوامل قارچی

جهت جداسازی عامل بیماری قطعات کوچک به اندازه 5×5 میلیمتری از حد فاصل بین بافت سالم و آلوده چوب تهیه و به مدت سه دقیقه در NaOCL نیم درصد ضد عفونی و با آب استریل شستشو شدند. قطعات سترون شده بعد از خشک شدن کامل بر روی محیط کشت PDA - عصاره سیب زمینی-دکستروز-آگار - قرار داده شدند. تشتک های پتری در انکوباتور با دمای 25 & نگهداری و جدایه های بدست آمده با روش نوک ریسه یا تک اسپور خالص سازی شدند. شناسایی جدایه ها نیز بر اساس کلیدهای موجود انجام شد.

-3-2شناسایی جدایه های قارچی

جهت شناسایی جدایه های قارچی بدست آمده از ویژگی های ریخت شناختی و محیط کشت - بر اساس روش فلیپ و همکاران - 2013 و همچنین روش های مولکولی استفاده شد. از ویژگی های ریخت شناختی مهم مانند رشد سریع در محیط کشت، رنگ، اندازه، شکل و تعداد سلول اسپورها و همچنین رنگ و بافت پرگنه ها در شناسایی جدایه ها استفاده شد. به منظور تولید اسپور جدایه ها به محیط کشت آب-آگار - Water agar - دو درصد حاوی قطعات برگ کاج استریل شده منتقل و به مدت 20 -12 روز در زیر نور مداوم نگهداری شدند. پس از اینکه اندام های باردهی - پیکنیدیوم - تولید شد از این اندام ها جهت بررسی میکروسکوپی اسلاید تهیه شد و ویژگی های آن ها مورد بررسی قرار گرفت. به منظور شناسایی مولکولی ابتدا جدایه های خالص شده بر روی محیط کشت PDA کشت و پس از 10 روز دی. ان. ای. از توده میسلیومی استخراج گردید. استخراج DNA بر اساس CTAB انجام شد. شناسایی جدایه ها به کمک روش PCR و تکثیر و تعیین ترادف ژن EF1-α با استفاده از دو آغازگر EF-728F و EF-986R و بخشی از ناحیه ITS با استفاده از دو آغازگر ITS1 و ITS4 و بر اساس روش هاشمی و محمدی - 2016 - انجام گردید. توالی های بدست آمده با برنامه BioEdit مورد بررسی قرار گرفتند و سپس با جست و جوی بﻻست و ترادف های مشابه موجود در بانک ژن در شبکه - http://ncbi.nlm.nih.gov/Blast - NCBI مقایسه و میزان شباهت هر جدایه با گونه های موجود در بانک ژن، مشخص گردید.

-3نتیجه گیری و بحث

در این مطالعه در برش های عرضی از شاخه های جمع آوری شده علائم داخلی بیماری به شکل تغییر رنگ بافت چوب مشاهده گردید - شکل . - 1 در این تحقیق 16جدایه قارچی از بافت تغییر رنگ یافته چوب شاخه درختان بیمار جداسازی گردید. همه جدایه های بدست آمده بر روی محیط کشت PDA دارای پرگنه های سفید رنگ بودند که از نرخ رشد بالایی نیز برخوردار بودند و این درحالی بود که هیچ گونه اسپوری بر روی محیط تولید نمی کردند. پس از دو روز رنگ پرگنه ها از سفید به سبز تیره تا سیاهرنگ تغییر یافت. در مرحله اول همه این جدایه ها به عنوان اعضای خانواده Botryosphaeriaceae در نظر گرفته شدند.

بعد از گذشت 15 تا 20 روز همه جدایه ها بر روی محیط کشت آب-آگار حاوی برگ های کاج تولید اندام باردهی - پیکنیدیوم - کردند. از بین 16 جدایه به دست آمده چهار جدایه بودند که بعد از اسپورزایی بر روی برگ کاج مشخص شد که دارای اسپورهای یک سلولی روشن هستند که بعد از گذشت زمان اسپورهای مسن به شکل دو سلولی تیره با رگه های طولی دیده شدند. بر اساس منابع موجود همه این جدایه ها به عنوان Lasiodiplodia theobromae در نظر گرفته شدند

جدایه باقی مانده نیز دارای اسپورهای تک سلولی قهوهای تا تیره کردند که بر اساس ویژگی های ریخت شناختی به عنوان Diplodia seriata شناسایی شدند - شکل . - 3 شناسایی جدایه ها به کمک روش 3&5 و استفاده از دو ژن ITS و EF1-α با استفاده از جفت آغازگرهای ITS1 و ITS4 و EF-728F و EF-986R انجام شد که به ترتیب نوارهایی در حدود 600 و 300 جفت برای جدایه های مورد مطالعه تکثیر گردید - شکل - 4 که بعد از تعیین ترادف، تصحیح و مقایسه آنها با گونه های موجود در بانک ژن، جدایه های منتخب از هر گونه 99 تا 100 درصد با گونه مربوطه هومولوژی داشتند. تاکنون گونه های زیادی از اعضای خانواده Botryosphaeriaceae از نقاط مختلف دنیا و همچنین ایران بر روی درختان مختلف گزارش شده است ولی این مطالعه اولین گزارش از وقوع این دو گونه بر روی درختان اکالیپتوس در ایران می باشد

در متن اصلی مقاله به هم ریختگی وجود ندارد. برای مطالعه بیشتر مقاله آن را خریداری کنید