بخشی از مقاله
مروري بر توليد آلفاآميلاز ميکروبي و کاربردهاي صنعتي آن
آميلازها از مهمترين آنزيم هاي مورد استفاده در صنعت هستند. اين آنزيم ها مولکول هاي نشاسته را به پليمرهاي کـوچکتر کـه از واحدهاي گلوکز تشکيل شده اند هيدروليز مي کنند. رايج ترين و مهمترين شکل آميلازهاي صنعتي ، آلفاآميلازها مي باشـند کـه از منابع مختلفي مانند گياهان، حيوانات و ميکروارگانيسم ها مشـتق مـي شـوند. آلفاآميلازهـاي ميکروبـي عمـدتا از منـابع قـارچي و باکتريايي هستند و در بخش هاي مختلف صنعتي مانند صنايع غذايي ، نساجي ، کاغذ و شوينده کاربرد دارند. در اين مقالـه مـروري، به بررسي توليد آلفاآميلاز و کاربردهاي صنعتي آن پرداخته شده است .
واژگان کليدي : آميلاز، آلفاآميلاز، نشاسته ، هيدوليز، کاربردهاي صنعتي
مقدمه
در سال هاي اخير کاربرد آنزيم ها به عنوان کاتاليزور زيستي در بخـش هـاي مختلـف صـنعتي افـزايش يافتـه اسـت ( & Sjofjan ٤١١ :٢٠١١ ,Ardyati) در بين آنزيم هاي مورد استفاده در صنعت آميلازها از مهمترين آنها هستند که در بيوتکنولوژي امـروز نيـز بسيار مورد توجه مي باشـند (٨٥٠ :٢٠١٠ , de Oliveira e Magalhaes &Monteiro de Souza ). اولـين آنزيمـي کـه بـه صـورت صنعتي توليد شد يک آميلاز از منبع قارچي ، در سال ١٨٩٤ بود که به عنوان دارو براي درمان اختلالات گوارشـي اسـتفاد مـي شـد (٢٠٠٠:١٣٥ ,.Pandey, et al). اين آنزيم ها هيدروليز مولکول هاي نشاسته به پليمرهاي کـوچکتر متشـکل از واحـدهاي گلـوکز را کاتاليز مي کنند (٨٥٠ :٢٠١٠ ,esde Oliveira e Magalha &Monteiro de Souza ). در حال حاضر حدود ٢٥ تا ٣٣ درصد از بـازار جهاني را به خود اختصاص داده اند (٢٠١٢:١٨ ,.Sahnoun, et al).
بر مبناي روش عملکرد، آميلازها به سه دسته اندوآميلازها (آلفاآميلازها)، اگزوآميلازها (بتاآميلاز، گلوکـوآميلاز و آلفاگلوکوزيـداز) و آنزيم هاي بدون شاخه (پولولانز، ايزوآميلاز) طبقه بندي مي شوند(٢٠١٣:١٠ ,Gaur &Rana, Walia, ).
- اندوآميلازها: پيوندهاي (٤-١)α دروني را مي شکنند و نتيجه آن محصول α-آنومريک است .
- اگزوآميلازها: پيوندهاي (٤-١)α يا (٦-١)α از باقيمانده هاي گلوکز را مي شکنند و محصـولات α يـا н-آنومريـک نتيجـه عمل آنهاست .
- آنزيم هاي بدون شاخه : منحصرا پيوندهاي (٦-١)α را مي شکنند در نتيجه پلي ساکاريدها با زنجيـر طـولاني ايجـاد مـي شوند.
آلفاآميلازها (٣٢١١.E.C) اندو آميلازهايي هستند که هيدورليز پيوندهاي (٤-١)α دروني در نشاسته را به صورت تصادفي کاتاليز مي کنند (١٧٤٥ :٢٠٠٤ ,Liakopoulou-Kyriakides &Konsula ). اين آنزيم ها در گياهان، بافت هاي حيواني و ميکروارگانيسم هـا يافت مي شوند (١ :٢٠١٣ ,.Xie, et al). منابع ميکروبي براي توليد آنزيم آميلاز، خصوصا براي کاربردهاي صنعتي تـرجيح داده مـي شوند زيرا مزايايي از قبيل تنوع ژن هاي ميکروبي در محيط زيست ، فعاليت بالاي آنزيمي در رنج وسـيعي از شـرايط (pH شـديد، دما، فشار و غيره)، ساده و کم هزينه بودن روش توليد را دارا مي باشـند( ٩ :٢٠١٣ ,Gaur &Rana, Walia, ). اگـر چـه بسـياري از ميکروارگانيسم ها اين آنزيم را توليد مي کنند، اما معمولا براي کاربرد صنعتي از گونه هاي Bacillus licheniformis ،Bacillus amyloliquefaciens و Aspergillus niger استفاده مي کنند (٨٩ :٢٠٠٩ ,Indhumathi &Vidyalakshmi, Paranthaman, ).
آلفاآميلازها در رنج وسيعي از فرآيندهاي صنعتي مانند صنايع غذايي ، نساجي ، کاغذ، شوينده و داروسازي کاربرد دارنـد ( Monteiro٢٠١٠:٨٥١ ,de Oliveira e Magalhaes &de Souza ). متداول ترين روش توليد، تخمير غوطـه ور و تخميـر حالـت جامـد اسـت ( .(Saban Tanyildizi, O zer, & Elibol, 2007:294
ساختار آلفاآميلاز
آلفاآميلاز ((٤-١)α گلوکان-٤-گلوکانوهيدرولاز، ٣٢١١.E.C) به صورت تصادفي هيدروليز پيونـدهاي (٤-١)α گليکوزيـدي پلـي ساکاريدها مانند نشاسته و ديگر پلـي سـاکاريدها ماننـد گليکـوژن را کاتـاليز مـي کننـد ( de Oliveira e &Monteiro de Souza ٨٥١ :٢٠١٠ , Magalhaes و ٢٠١٣:٩ ,Gaur &Rana, Walia, ). آلفاآميلاز يک ساختار سه بعدي دارد که مي تواند با سوبسترا پيوند برقرار کند و با عمل بسيار خاص گروه هاي کاتاليزوري باعث شکست پيوندهاي گليکوزيدي شود. آلفاآميلاز انساني حـاوي کلسـيم ، آنزيمي است متشکل از ٥١٢ آمينواسيد در يک زنجير اليگوساکاريدي و وزن مولکولي آن ٥٧.٦ کيلودالتون مي باشد ( Monteiro ٢٠١٠:٨٥١ , de Oliveira e Magalhaes &de Souza ). اين پروتئين شامل سه حوزه A،B و C است . حوزه کاتـاليزوري حفاظـت شده (حوزه A)، شامل ساختار لوله اي (حاوي ٨ مارپيچ آلفا و ٨ صفحه بتا) و مکان فعـال اسـت . حـوزه هـاي B وC در دو سـمت مقابل از اين ساختار لوله اي قرار گرفته اند. حوزه B با پيوند دي سولفيد به حوزه A متصل است و حوزه C داراي ساختار صفحه н
است که بوسيله يک زنجير پلي پپتيدي ساده به حوزه A متصل است و يک حوزه مستقل به نظر مي رسد که عملکرد آن شـناخته شده نيست . جايگاه فعال (محل پيوند سوبسترا )، در يک شکاف محلي بين انتهاي کربوکسيل حوزه هاي A وB قرار گرفتـه اسـت .
آلفاآميلازها، متالوآنزيم هاي حاوي کلسيم هستند که يون کلسيم به کمک دو صفحه н يکي از حوزه A و ديگري ازحـوزه B، نگـه داشته مي شود. اين يون در پايداري ساختار سه بعدي و نيز به عنوان فعال کننده آلوستريک عمل مي کند ( Monteiro de Souza (de Oliveira e Magalhaes , 2010: 851 , Rana, Walia, & Gaur, 2013:9
شکل (١): ساختار سه بعدي آلفاآميلاز. حوزه A به رنگ قرمز، حوزه B به رنگ زرد و حوزه C به رنگ ارغواني نشان داده شده است . در مرکز کاتاليستي ، يون کلسيم به شکل کره آبي رنگ و يون کلريد کره زرد رنگ نشان داده شده است . وساختارهاي سبزرنگ پيوند به مکان فعال و به محل هاي اتصال در سطح نشان مي دهد ( de Oliveira e Magalhaes &Monteiro de Souza (, 2010:85
نشاسته
نشاسته يک پلي ساکاريد ناهمگن است که از دو پليمر با وزن مولکولي بالا با نام هاي آميلوز و آميلو پکتـين ، تشـکيل شـده اسـت . اين دو پليمر ساختار و خواص متفاوتي دارند ( ١٥٢٥ :٢٠٠٥ ,V. Aiyer). ساختار آميلوز در شکل (٢) نشان داده شده است . آميلوز، يک پليمر خطي ، شامل بيش از ٦٠٠٠ واحد گلوکز با پيوندهاي (٤-١)α گليکوزيدي است (٢٠١٢:٥٩٠ ,Mojsov) به شدت بوسـيله آلفاآميلاز تجزيه مي شود (١٥٢٦ :٢٠٠٥ ,V. Aiyer). آميلوپکتين داراي زنجيرهاي خطي متشکل از ١٠ تا ٦٠ واحد گلوکز با پيوند کوتاه (٤-١)α و زنجيرهاي جانبي متشکل از ١٥ تا ٤٥ واحد گلوکز با پيوندهاي (٦-١)α است (٥٩٠ :٢٠١٢ ,Mojsov). در شکل (٣) ساختار آميلوپکتين ، نشان داده شده است . هيدروليز نشاسته هم به روش اسيدي و هم به روش آنزيمي انجام مـي شـود. بـه دليـل مزاياي هيدروليز آنزيمي از قبيل تشکيل محصولات جانبي کمتر، بازده بالاتر و نيز ملايم تر بودن شرايط هيدروليز، سال هاست کـه هيدروليز نشاسته در مقياس صنعتي به اين روش انجام مي شود و تقريبا به طور کامل جايگزين هيدروليز اسيدي شـده اسـت ( .V .(Aiyer, 2005: 1526
شکل (٢): آميلوز (٨٥١ :٢٠١٠ , de Oliveira e Magalhaes &Monteiro de Souza )
شکل (٣): آميلوپکتين (٢٠١٠:٨٥١ , de Oliveira e Magalhaes &Monteiro de Souza )
توليدآلفاآميلاز
توليد آلفاآميلاز به دو روش تخمير غوطه ور و تخمير حالت جامد، به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفتـه اسـت ( & Sharma ٢٠١٣:٢٠٢ ,Satyanarayana) بسياري از آنزيم هاي مهم صنعتي به روش تخمير غوطه ور توليد شده اند و اکثر محيط کشـت هـاي سنتزي توليد آلفاآميلاز باکتريايي ، بصورت کشت غوطه ور مي باشد، با اين حال در چند دهه گذشته تمايل بـه اسـتفاده از تخميـر حالت جامد براي توليد آنزيم هاي مهم صنعتي رو به افزايش است (٣٥٠ :٢٠١٢ ,Baruah &Narayan Swargiari ).
تخمير غوطه ور
تخمير غوطه ور شامل غوطه ور شدن ميکروارگانيسم ها در يک محلول سوسپانسيون حاوي همه مواد مغذي براي رشد، مي باشـد.
روشي است که معمولا براي توليد بالاي بسياري از محصولات مانند الکل ، اسيدهاي آلي ، آنزيم ها، ويتـامين هـا و اسـيدهاي آمينـه استفاده مي شود. يک عامل محدودکننده در تخمير غوطه ور انتقال جرم از فاز گاز به فـاز مـايع اسـت کـه بـا اخـتلاط مناسـب از محدوديت انتقال مواد مغذي در محيط کشت جلوگيري مي شود. از مزاياي اين سيستم مـي تـوان بـه بـازدهي مناسـب در نتيجـه اخــتلاط يکنواخــت و هزينــه پــايين فرآينــدهاي مربــوط بــه اســتخراج محصــول اشــاره کــرد ( & Ricardo Soccol, Pandey .(Larroch,2013:167
تخمير حالت جامد
تخمير حالت جامد معمولا به عنوان رشد ميکروارگانيسم ها روي سوبسـتراهاي جامـد مرطـوب، بـدون آب آزاد تعريـف مـي شـود
(٢٠٠٠:١٧ ,.Pandey, et al). اين روش به فرآيندهاي شامل قارچ محدود مي شود. با اين حال رشد باکتري نيز در اين سيسـتم هـا موفق بوده است (٢٠١٣:١ ,Gaur &Rana, Walia, ). از مزاياي تخمير حالت جامد نسبت به تخمير غوطه ور مـي تـوان بـه بـازدهي بالا، ساده تر بودن روش، سرمايه گذاري کم ، انرژي مورد نياز کمتر، خروجي آب کمتر، بازيابي بهتر محصول و عدم ايجاد کف اشاره کرد (٢٩٤ :٢٠٠٧ ,Elibol &Saban Tanyildizi, O zer, ).
ضايعات کشاورزي مانند سبوس گندم، سبوس ذرت، سبوس برنج ، پوسته برنج ، کيک روغن نارگيل ، کيک روغن خردل و غيـره، بـه عنوان بهترين سوبستراها در اين فرآيندها استفاده مي شوند زيرا سوبستراهاي ارزان قيمتي هستند و به حل مشکلات آلـودگي نيـز کمک مي شود (٥٩٢ :٢٠١٢ ,Mojsov).
پارامترهاي موثر بر توليد آلفاآميلاز
عوامل فيزيکي و شيميايي مختلفي مانند دما، pH ، منابع کربني به عنوان محـرک، منـابع نيتروژنـي ، يـون هـاي فلـزي مختلـف ، رطوبت ، سورفکتانت ها زمان انکوباسيون، اندازه ذرات سوبسترا و همزدن بر توليد آلفاآميلاز موثر هستند ( ,Gaur &Rana, Walia, .(2013: 11
دما
تاثير دما روي توليد آميلاز به رشد ارگانيسم بستگي دارد از اين رو درجه حرارت مطلوب با توجه به مزوفيل يـا ترموفيـل ارگانيسـم تعيين مي شود . در بين قارچ ها اکثر مطالعات مربوط به توليد آميلاز با قارچ مزوفيل در رنج دمايي ٣٧-٢٥ درجه سـانتيگراد، بـوده است (١٧٥ :٢٠٠٦ ,Pandey &Sivaramakrishnan, Gangadharan, Nampoothiri, Ricardo Soccol, ). آلفاآميلازهـاي باکتريـايي در گستره وسيع دمايي توليد مي شوند. توليد آنزيم با گونـه هـاي باکتريـايي ماننـد Bacillus amyloliquefaciens ،Bacillus subtilis ،Bacillus licheniformis و Bacillus stearothermophilus در رنج دمايي ٦٠-٣٧ درجه سـانتيگراد و گونـه هـاي فـوق گرمادوسـت ماننـد Thermococcus profundu و Thermotoga maritime ، در دمـاي C٨٠ ( ,Narayan Swargiari
٢٠١٢:٣٥٢) گزارش شده است . ماکزيمم بازده آميلاز از گونه قارچي Aspergillus niger BANE٣ به روش تخمير حالـت جامـد در دماي C ٣٧ (١٧٥٩ :٢٠١١ ,etal &R ). و بوسيله Streptomyces sp. MSC٧٠٢ در تخمير غوطه ور در دمـاي C٥٠ بـوده است (٥٤٠ :٢٠١١ ,Kumar &Singh, Kapoor, ). همچنين پويا رضايي و همکارانش دماي بهينه توليد آلفـاآميلاز از Aspergillus ٥٤٨ niger NCIM در محيط کشـت غوطـه ور، ٧٠ درجـه سـانتيگراد، گـزارش کردنـد ( & ,Sirous Rezaei, Najafpour Darzi٢٠١٠:٩٢٤ ,Shafaghat). آلفاآميلاز از گونه Anoxybacillus flavitherm دردماي C٥٥ مـاکزيمم فعاليـت را نشـان داده اسـت
.(Aguloglu Fincan, Enez, Ozdemir, & Matpan Bekler, 2014:144)
pH
pH يکي از مهمترين فاکتورهاي تعيين کننده رشد و مورفولوژي ميکروارگانيسم ها است ، زيرا ميکروارگانيسم هـا بـه حضـور يـون هاي هيـدروژن در محـيط حسـاس هسـتند ( ,Pandey &Sivaramakrishnan, Gangadharan, Nampoothiri, Ricardo Soccol, ٢٠٠٦:١٧٥). بر مبناي pH بهينه فعاليت ، آلفاآميلازها به سه دسته اسيدي، خنثي يا قليـايي طبقـه بنـدي مـي شـوند. pH بهينـه آلفاآميلازها در رنج ١٢-٢ است (٢٠٢ :٢٠١٣ ,Satyanarayana &Sharma ). مطالعات قبلي نشـان داده اسـت ، قارچهـا، بـراي رشـد مطلوب، معمولا به مقادير pH در بازه اسيدي و باکتريها به pH خنثي و قليايي ، نياز دارند. البته در اين زمينه استثنائاتي نيز، وجود دارد. توليد بهينه آميلاز از Aspergillus SP MK٠٧ به روش تخمير حالت جامد در pH برابر ٥ گزارش شده است ( ,Chimata, P ٥١٦٢ :٢٠١٠ ,Challa & ). آلفاآميلاز توليدي از باکتري قليادوست Bacillus licheniformis ASE٠٨ ، در pH برابر ١٠، فعاليـت بهينه اي نشان داده است (٢ :٢٠١٣ ,K. Mukherjee &K. Roy ). همچنين ماکزيمم توليـد آنـزيم آلفـاآميلاز از گونـه Bacillus ٢٠٠٤ subtilis JS در کشت غوطه ور در ٧=pH بوده است (٩٥ :٢٠٠٧ ,Legge &Asgher, Javaid Asad, Rahman, ) . پويا رضايي و همکارانش توليد بهينه آلفاآميلاز از قارچ ٥٤٨ Aspergillus niger NCIM در محيط کشت غوطه ور در مقدار ٤= pH گـزارش کردند (٩٢٤ :٢٠١٠ ,Shafaghat &Sirous Rezaei, Najafpour Darzi, ).
منابع کربني
آلفاآميلاز معمولا در حضور نشاسته يا محصول هيدروليزي آن ، مانند مالتوز فعال مي شود. در بيشتر گزارش هاي موجود، مالتوز بـه عنوان محـرک آلفـاآميلاز توليـدي از Aspergillus oryzae ، معرفـي شـده اسـت ( & ,Gupta, Gigras, Mohapatra, Goswami
.(Chauhan, 2003:1602
منابع کربني مانند دکسترين ، فرکتوز، گلوکز، لاکتوز، مالتوز و نشاسته براي توليد تجاري اين آنـزيم هـا بسـيار گـران قيمـت مـي باشند. از اين رو مي توان اين منابع گران قيمت را با ضايعات کشاورزي مانند سبوس، کـاه و آرد غـلات مختلـف ماننـد جـو، ذرت، کاساوا، سيب زميني ، برنج ، سورگوم و گندم و يا مواد نشاسته اي صنعتي در محيط تخمير جهت افزايش توليد آنزيم جايگزين کـرد (٢٠٨ :٢٠٠٧ ,niorFreitas Chagas Ju &Nascimento de Oliveira, Antonio de Oliveira, Sousa Andrade, ). پويـا رضـايي و همکارانش از هيدروليزات تفاله نيشکر به عنوان منبع کربني براي رشد و درنتيجه توليد آنـزيم آلفـاآميلاز از Aspergillus niger ٥٤٨ NCIM استفاده کردند (٩١٩ :٢٠١٠ ,Shafaghat &Sirous Rezaei, Najafpour Darzi, ).
منابع نيتروژني
در توليد آلفاآميلاز، منابع نيتروژني آلي ترجيح داده مي شوند ( ٢٠٠٣:١٦٠٢ ,.Gupta, et al). از بـين منـابع نيتروژنـي آلـي مـورد بررسي در توليد آنزيم از گونـه Bacillus subtilis، تريپتـون و شـربت خيسـانده ذرت اثـر مطلـوبي داشـته انـد ( & Konsoula ١٥٠ :٢٠٠٧ ,Liakopoulou-Kyriakides). در توليد آلفاآميلاز از قارچ Aspergillus niger ATCC١٦٤٠٤، عصاره مخمر اثر منفي و شربت خيسانده ذرت اثري نداشته ، اما باعث تحريک توده زيستي جهـت سـنتز پـروتئين شـده اسـت ( ,Djekrif-Dakhmouche ٢٠٠٦:١٩٠ ,Bennamoun &Gheribi-Aoulmi, Meraihi, ). پپتون به عنـوان منبـع نيتروژنـي در محـيط توليـد آلفـاآميلاز خـارج سلولي از گونه Aspergillus SP MK٠٧، باعث افزايش در توليد گشته است (٥١٦٢ :٢٠١٠ ,Challa &Chimata, P, ).
يون هاي فلزي
افزودن مکمل هايي از جمله نمک يون هاي فلزي خاص، مي توانند اثر مثبت و يا منفي بر روي رشـد ميکروارگانيسـم و در نتيجـه توليد آنزيم داشته باشند. اکثر آلفاآميلازها يک متالوآنزيم ، حاوي حداقل يک يون کلسيم ، مي باشند. ميل ترکيبي يون هاي کلسيم به آلفاآميلاز نسبت به يون هاي ديگر بيشتر است . مقدار يون کلسيم از ١ تا ١٠ متفاوت است (٢٠١٣:١٢ ,Gaur &Rana, Walia, ).
