بخشی از مقاله
معرفي روشي سريع و کارا براي ارزيابي ژنتيکي دانه هاي برنج و ساير غلات غني از نشاسته
چکيده
استخراج DNA با اهداف متفاوت ژنتيکي از جمله PCR و توالي يابي صورت ميگيرد. نخستين گام در بررسيهاي مولکولي استخراج اسيدهاي نوکلئيک با کيفيت مطلوب ميباشد.در بسياري از گياهان بدليل وجود برخي ترکيبات مانند پلي ساکاريدها، پليفنلها و پروتئينها، دستيابي به DNA خالص و باکيفيت جهت انجام PCR و آناليز ماکرهاي مولکولي مبتني بر PCR با دشواريهايي همرا است . ما در اين پژوهش سعي کرديم با تغيير و ترکيبي از مواد و روشهاي مختلف استخراج DNA به دو روش ساده و تکرار پذير دست يابيم که مورد استفاده براي ارزيابي ژنتيکي دانههاي برنج و ساير دانههاي غلات غني از نشاسته باشد. کميت و کيفيت DNA استخراج شده با استفاده از روشهاي اسپکتروفتومتري، ژل آگارز درصد، هضم با استفاده از آنزيمهاي محدود کننده EcoR١ و Mse١، و انجام واکنش زنجيرهاي پليمراز(PCR) بررسي گرديد.اين دو روش ميتواند بطور موفقيت آميزي براي استخراج DNA از بذور غلات غني از نشاسته نظير برنج مورد استفاده قرار گيرد.
کلمات کليدي : استخراج DNA برنج ، کميت و کيفيت DNA استخراج شده
مقدمه
برنج از مهمترين غلات و اقلام غذايي جهان است . نيمي از جمعيت جهان به برنج به عنوان يک غذاي اصلي وابسته اند.
امروزه از روشهاي مولکولي در سطح وسيعي براي اصلاح گياهان زراعي از جمله برنج استفاده ميشود. اين تکنيکها عمدتاً براي نقشهيابي ژني، تشخيص ژنوتيپهاي مطلوب ، مطالعات تکويني و فيلوژنتيک به کار ميروند. در اين راستا جداسازي DNA از تعداد زيادي نمونه در مدت زمان کوتاه ضرورت دارد، بنابراين در قدم اول نياز به استفاده از يک روش استخراج DNA که ساده ، سريع ، کم خطر و مقرون به صرفه باشد احساس ميشود.استخراج DNA از بذر برنج و ساير غلات غني از نشاسته با محدوديتهايي از جمله وجود سطوح بالايي از نشاسته هراه است . در اين پژوهش سعي شده يک روش سريع و کارآمد جهت خالص سازي DNA از بذر برنج و ساير غلات حاوي نشاسته ارايه شود.
مواد و روشها
مواد ژنتيکي مورد مطالعه ، نمونههاي بذري تعدادي از ارقام برنج بود که در آزمايشگاه ژنوميکس پژوهشکده ژنتيک و زيست فناوري کشاورزي طبرستان مورد آزمايش قرار گرفتند . استخراج DNA به دو روش SDS mini-prep تغيير يافته و روش Taiو Tanskey با تغييراتي به صورت زير انجام گرفت :
SDSmini-prerpتغييريافته گرم از بذر برنج که از قبل در فريز قرار داشته را در نيتروژن مايع کاملاً پودر شد. (البته بدون استفاده از ازت مايع هم ميتوان دانه هاي برنج را در هاون پودر کرد).
ميکروليتر از بافر استخراج DNA ( حاوي Tric Hcl با غلظت ميليمولار با غلظت ميليمولار وPH ،NaC l 500ميليمولار ، SDS با غلطت 25درصد، 2- مرکاپتواتانول 1درصد که به صورت تازه به بافر اضافه ميشود با PH نهايي به نمونه پودر شده اضافه گرديد.
تيوبهاي حاوي نمونه به مدت دقيقه در حمام آب گرم در دماي 65 درجه قرار گرفته ، هر 5 الي10 دقيقه تيوبها به آرامي اينورت شده ، هم حجم محلول ، داخل تيوب کلروفرمي که از قبل در فريزر 20- قرار داشته اضافه گرديد. نمونهها با شدت دور rpm ( به جاي rpmدبه مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ شد.
2- فاز رويي به تيوپهاي جديد منتقل گرديده و مرحله 4و5 مجددًا تکرار ميشود.
3- هم حجم محتواي داخل تيوب ، ايزوپروپانول سرد براي رسوب دادن DNA استفاده شده و در دماي4 درجه حداقل به مدت 3 ساعت نگهداري گرديد. نمونهها را به مدت 10 دقيقه با شدت دور سانتريفيوژ کرده و پلت DNA را با الکل درصد دوبار شستشو داده و سپس اجازه ميدهيم تا رسوب خشک شود اما نه کاملا خشک .
4- پلت DNA را در 200 ميکروليتر بافر TE حل کرده و به منظور حذف نشاسته و ديگر ترکيبات نامحلول ، نمونههاي DNA را با شدت دور rpm 1000 به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ مينماييم . محتويات تيوب را به يک تيوب جديد منتقل و يک دهم حجم ، استات سديم 3 مولار اضافه کرده و با شدت دور rpm 1000 به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ مينماييم و مايع رويي را به تيوب جديد منتقل و هم حجم آن ايزوپروپانول اضافه و يک ساعت در 20- نگهداري ميگردد و با شدت دور rpm 1300 به مدت3 دقيقه سانتريفيوژ ميشود و پلت را با الکل 70 درصد شستشو داده و پس از خشک شدن ، در TE حل مي نماييم . ميکروليتر آنزيم به جهت حذف RNA به نمونهها اضافه گرديده و مدت 1 ساعت در دماي 37 درجه نگهداري ميشود.
Tai و Tanskey تغيير يافته دانه برنج را در هاون کوبيده و به تيوب 600 ميليليتر انتقال داده ميشود . ميکروليتر بافر استخراج DNA (حاوي Tris-Hcl با غلظت 10 ميليمولار، EDTA 50 ميليمولار ، NaCl 500 ميليمولار ، SDS درصد، NaOH ميلي مولار، مرکاپتواتانول 1 درصد با PH نهايي 8 ) به نمونهها اضافه مي گردد. تيوب حاوي نمونهها را در حمام آب گرم در دماي60 درجه به مدت 15 دقيقه قرار داده ميشود.(دقت شود که نمونهها حالت ژلاتينه پيدا نکند، بدين جهت بهتر هر چند دقيقه آرام اينورت گردد). 220 ميکروليتر استات پتاسيم 5 مولار به تيوپها اضافه کرده و نيم ساعت روي يخ قرار ميدهيم . سپس با شدت دور rpm1200 به مدت 3 دقيقه سانتريفيوژ نموده ، مايع رويي را به تيوپ جديد منتقل کرده و هم حجم آن ايزوپروپانول سرد اضافه ميگردد و به مدت 1 ساعت در فريزر 20- نگهداري ميشود.
با شدت دور rpm1200به مدت 3دقيقه سانتريفيوژ کرده و پلتهاي مجتمع شده را با الکل 70 درصد شستشو داده و اجازه ميدهيم تا خشک شود اما نه کاملاً خشک . پلتها را در 2 ميکروليتر بافر TE٥ (حاوي Tris-Hcl 50 ميليمولار و 8=PH و EDTA 10 ميليمولار ) حل کرده و 30ميکروليتر استات سديم 3 مولار با 2/5 =PH اضافه نموده به آرامي مخلوط مي شود.
4- در اين مرحله سانتريفيوژ با شدت دور rpm 1300 به مدت 3 دقيقه انجام ميگيرد. محتويات تيوبها را به تيوبهاي جديد منتقل کرده و 330 ميکروليتر ايزوپروپانول سرد اضافه نموده و به مدت 1 ساعت در فريزر 20- نگهداري ميشود. با شدت دور rpm به مدت 3 دقيقه سانتريفيوژ ميگردد.
پلتها را در الکل 70درصد شستشو داده و پس از خشک شدن در 330 ميکروليتر بافر TE حل نموده و در 20- درجه به مدت
